蛇毒类毒素的人群免疫

第一年基础免疫2剂（间隔3-4天），每剂0.5ml-0.7ml皮下注射。第二年加强免疫1针，lml皮下注射。以后每隔35年注射1针，每次皮下注射1ml。

安徽中医学院免疫学研究室制定的蕲蛇类毒素吸附试验规程草案及蕲虫类毒素吸附说明书如下：

确定吸附的蝰蛇类毒素的方案草案

(―) 定义和性质

吸附芾龙类毒素是由蕲蛇毒素经甲醛脱毒后经磷酸铝吸附制成的不溶性制剂。仍保留原有抗原性，摇匀后变为乳白色均匀混浊悬浮液。

（二）准备程序

物干蕲蛇毒素。

初步排毒解决方案

蛇毒配制：用新鲜的中性或弱酸弱碱性无菌生理盐水（或PH7.0，66.7mol/LPBS）在无菌操作下配制成10mg/ml（或2mg/ml）的蛇毒溶液。

解毒提纯：用低浓度甲醛在37作用，使白花蛇毒完全解毒，按后述“（三）质量标准检验”中“一、初解毒液检测标准”检查无毒。 “执行。

最好在解毒前或解毒后纯化去除与出血性和致死性（主要是神经毒性）毒性无关的蛋白质成分。

类毒素应用方案

浓度：高浓度解毒液用新鲜的中性或弱酸性无菌生理盐水稀释，使蛋白质含量为1.6mg/ml（如用2mg/ml豊蛇毒解毒，必须用无菌生理盐水透析后配成a浓度为1.6 毫克/毫升）。

除菌过滤：按照后述“(3)质量标准检验”中的“1.初始解毒液检测标准”进行检测。

吸附蝰蛇毒素用磷酸铝吸附1012周，去上清后，加入无菌生理盐水使终蛋白含量约为1.6 mg/ml，再加入0.01%硫柳汞（W/V），按“检测”后述“(3)质量标准检验”中的“2.类毒素应用液检验标准”。

（三）质量标准检验

1、解毒液初步检测标准

无病毒（无毒）检查：

致死毒素（主要是神经毒素）:解毒待测液0.5ml，小鼠腹腔注射（16g），至少注射4次。喂养观察2天，若无特殊的蕲蛇毒中毒症状，或其他异常体征，即为完全解毒。同时使用放置在37的排毒液20天进行上述检查，也应该是无毒的。

取出血毒素：待测解毒液0.1ml为小鼠(18g)，一侧后肢肌肉注射(另一侧用0.1ml无菌生理盐水作为对照)，至少2小鼠被注射。喂食观察24小时，局部无明显水肿出血，说明完全解毒，毒性逆转试验也为阴性。

类毒素应用溶液检测标准

无菌试验： 铝盐吸附前，需按常规方法进行好氧苗、厌氧菌、霉菌、支原体的无菌试验，保证绝对无菌生长。

纯度检测：采用常规半微量定氮法测定蛋白氮含量，蛋白含量应达到或接近1.6mg/ml。

LF测定：按常规方法检查，应不低于100LF/ml。

吸附毒蛇类毒素成品检验标准

物理性质： 摇匀后为乳白色均匀悬浮液，无凝块或其他残留异物。

pH:按常规方法检查，应在pH6.8左右。

按常规方法，磷酸铝：的含量应为1mg/ml（或5mg/ml）。

:按常规检验其氯化钠含量应为0.85%0.9%。

:的甲醛含量按常规方法检测应小于0.02%。

硫柳汞：的含量按常规检验应小于0.012%（W/V）。

:的含氮量用常规方法检查，应在或接近0.256mg/ml。

无菌试验：按常规方法检查，应无菌生长。

安全性试验： 豚鼠：4ml 成年豚鼠2只腹壁两侧皮下注射毒蛇类毒素，每侧1ml，每侧皮下注射等量无菌生理盐水作为对照。 2天内局部无红肿，豚鼠无中毒症状，2周内无局部组织坏死。

小鼠将吸附的类毒素：0.5ml腹腔注射给小鼠(16g)。共注射4只小鼠，2天内无任何中毒症状。病理切片检查，仅在24小时前偶见吸附剂刺激引起的散发性点状出血； 24 小时后完全吸收。

功效测试： 使用豚鼠进行中和抗体的效价滴定。

待测材料： 吸附Agkistrodon 类毒素； Agkistrodon 毒液（目前没有提及Agkistrodon 类毒素）。

实验方法： 给豚鼠（300g~400g）皮下注射类毒素0.3ml（或按对数级数取量），注射豚鼠15只（随机分为抗体检测组10只，保护试验组5只） ，间隔4周后重复注射，第2次注射后4周，抗体测定组每只豚鼠抽血，按上项用血清固定法测定血清中和抗体滴度。另5只豚鼠根据保护率分别用一定量的大蛇毒液（后肢肌肉注射）进行攻击。

判断标准： 血清中和抗体的平均滴度不应低于0.125mg/ml。在防护实验中，它应该能够完全保护被1.6mg Agkistrodon halys毒液攻击的动物免于死亡。

如有对照类毒素，应同时观察血清中和抗体效价和保护性试验，用数学分析比较两者的差异，其效价不应低于对照品。

（四）贮存及有效期

4X：保存，有效期3年。

(5)人体使用方法

基础免疫：2针（间隔34个月），每针皮下注射0.7ml。

加强免疫：1针（基础免疫后1年），皮下注射1ml。

吸收毒蛇类毒素说明书

本品由响尾蛇类毒素加磷酸铝吸附剂制成。主要用于预防白花蛇的咬伤，对竹叶青、沙螽等毒蛇的咬伤也有一定的预防作用。

（一）接种对象

在被毒蛇严重咬伤的地区进行野外工作的可能性

被蝮蛇咬伤的人群(主要是成年人）以及蝮蛇的专职饲养研究

人员。

 

 

 

(二）用法

 

 

 

 

针 次

剂量(ml)

注射途径

 

          第1针

0. 7

皮下注射

          第1年

(间隔3周〜4周）

 

 

 

          第2针

0. 7

皮下注射

          第2年

注射1针

1

皮下注射

          第3年〜           第5年

每年加强1针

1

皮下注射

 

 

(三）禁忌

凡发热、急性传染病、肝病、心病、肾病、活动性结核、血液病（含出血性疾病）、中枢神经系统疾病后 遗症及有过敏史者不宜接种。

(四）反应

注射本品后一般无反应，个别接种后可有红肿、疼痛、发痒或有低热、疲倦、头痛等，一般不需处理， 可自行消退。

(五）注意事项

使用时应充分摇匀，如出现摇不散的沉淀颗粒，有异物、异色，安瓿有裂纹，封口不严，制品曾经冻 结，标签不清和过期者，均不可使用。

注射后，局部可能有硬结，1天〜2天即可吸收。注射          第二次应换另侧部位。

应预备1 : 1 000肾上腺素等急救药，供偶发过敏休克时急用。

(六）保存和有效期

保存于4X：〜itrc冷暗处（防止冻结）》有效期3年。

五、蛇毒脱毒的有关问题

不同种蛇毒的化学组成和结构不同，因此用甲醛脱毒法制备类毒素时，脱毒的条件和 方法也要因蛇毒而异。目前有采用粗毒脱毒，也有采用毒素的组分脱毒，还有对蛇毒的不 同毒性成分采用不同的pH条件进行脱毒制备类毒素。甲醛对蛇毒的脱毒作用尚存在一 些问题:①脱毒的原理尚未完全清楚，不同毒性成分脱毒的机制可能不同。②脱毒不全，有 些蛇毒的毒性成分不易脱失。如彩锯鱗蝰蛇毒在很宽的pH范围内用甲醛处理，并不能使 其完全脱毒，但其层析的出血毒组分则可被脱毒;沙漠眼镜蛇蛇 毒也不能被甲醛脱毒。③有些蛇毒不易在同一 pH条件下使多种毒素成分同时脱毒。巴勒 斯坦蝰蛇的神经毒只有在pH偏碱性的条件下才被甲醛脱毒，而且脱毒后即失去抗原性， 而其出血毒组分只有在偏酸性的条件下脱毒才有抗原性。④易失去抗原性。蛇毒抗原性 较弱，蝮蛇毒1. 0%(W/V)以上甲醛处理后出血毒性和致死毒性消失，其抗原性显著降 低。另有一些蛇毒即使在低浓度的甲醛处理下，脱去毒性后同时也失去了抗原性。因此， 应用甲醛对不同科或种的毒蛇毒进行脱毒制备类毒素时，应探研出各自既可脱去毒性而 又不影响或基本上不破坏抗原性的脱毒方法。

蝮蛇毒素是多种小分子多肽和蛋白质的混合物，内含蛋白水解酶、精氨酸酯酶、磷酸 二酯酶、L-氨基酸氧化酶、碱性磷酸单酯酶、核糖核酸酶、5'-核苷酸酶、三磷酸腺苷敏、二 磷酸腺苷酶、核苷焦磷酸酶、磷脂酶八2、舒缓激肽释放酶、抗凝血活酶和纤溶酶等十多种 酶类，表现出以凝血失调、组织坏死和出血等毒性为主兼有神经毒性的特性。神经毒具有 不可逆性阻遏神经-肌肉接头的传递作用，毒性较强，具致死活性，是蝮蛇咬伤急性中毒引 起死亡的主要原因。本脱毒实验结果表明在一定浓度的甲醛作用下，蝮蛇毒的出血毒和神 经毒可被脱去。

在一定的甲醛浓度范围内，蝮蛇毒的脱毒与甲醛用量、蛇毒浓度、脱毒温度和脱毒所 需的时间有一定的关系。从图3-16-1和图3-16-2中可以知道蛇毒浓度越大，脱毒所需的 时间越长，呈正相关(P<0.05h0.2%〜0.5%甲醛(W/V)有很好的脱毒效果。lmg/ml蝮

 

 

 

 

 

 

 

蛇毒液在28‘C下脱毒时，甲醛浓度与脱毒时间呈负相关。r = 0. 9583,P<0. 05。而在37°C 温度下，0.5mg/ml、lmg/ml、2mg/ml和3mg/ml的蝮蛇毒液，甲薛脱毒与其时间无明 显相关性。温度对甲醛的脱毒能力有很大关系，37°C比28°C有明显促进作用，脱毒的时间 约相差10倍。脱毒时弱酸或碱性环境(PH5. 2〜10)与脱毒能力无明显关系(表3-16-12)。 酸性能解除出血毒性，这与日本学者报道的在酸性(PH2. 7)条件下蝮蛇类蛇毒lh后出血 毒素即失活以及Moroz-Perlumtter等用甲醛对巴勒斯坦蝰蛇和彩锯鱗蝰蛇毒及其层析 组分的脱毒与pH有很大关系的报告基本相同。但可观察到，在PH3. 7的环境下，甲醛 长期脱毒制备的蝮蛇类毒素免疫动物，其保护率低于中性条件下脱毒者(P<0. 05)，而且 死亡小鼠腹腔皆有明显出血。说明该类毒素的出血毒性和神经毒性的免疫原性有所 降。

表3-16-12在不同PH条件下0. 2%甲醛(W/V)对2mg/ml蝮蛇毒脱毒能力

不同pH中致死毒素脱毒情况不同pH中出血毒素脱毒情况

脱毒天数（腹腔注射2天内，死亡鼠/注射鼠）（肌肉注射后24h局部出血情况）

 

 

3.7

5.2

7

9

10

3. 7

5.2

7

9

10

1

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

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2

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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3

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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4

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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5

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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6

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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7

2/2

2/2

2/2

2/2

2/2

 

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8

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*0/2

*0/2

*0/2

0/2

 

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+ +

9

0/2

0/2

0/2

0/2

0/2

 

 

 

 

 

 

 

因此，用酸性(PH<3. 7)来配合甲醛脱毒，应在出血毒性失活后立即纠正pH至弱酸 或中性，再继续进行致死毒素等的脱毒。日本学者曾用此法制备了蝮蛇类的蛇毒类毒素。

根据以上实验结果可知在弱酸、弱碱或中性的条件下，一定浓度甲醛可以使蝮蛇毒的 出血毒素和神经毒素等毒性完全脱失并可得到较好的免疫原性。以甲醛浓度而论,低浓度 对抗原性的破坏较小。从蛇毒的浓度来看，2mg/ml为佳，可以确保一定的抗原结合价。所 以我们采用0. 2%甲醛(W/V)在中性的环境中对2mg/ml蝮蛇毒素于37°C下处理9天进 行脱毒，制备了有一定免疫原性的吸附蝮蛇类毒素。