蛇毒 类凝血酶的分离纯化

响尾蛇毒和蝰蛇毒含有凝血酶样酶，尤其是蝰蛇毒液中含有丰富的凝血酶样酶。类凝血酶具有精氨酸酯酶活性，可直接作用于纤维蛋白原使其凝固。其作用与人或牛的凝血酶相似，故称为类凝血酶。在类凝血酶的分离方面做了大量工作，许多蛇毒中的类凝血酶已被纯化和部分纯化。在此介绍关凤丽等人从白花蛇毒中分离纯化类凝血酶的过程。 （1982）。鉴于蛇毒成本较高，特设计了部分步骤综合利用，读者可根据自身情况制定纯化步骤。

1. SephadexG-25柱层析为了综合利用蛇毒中的多种活性成分，

先用SephadexG-25分离活性小肽——缓激肽增强因子。取粗毒21g，分7批，每批3g，溶于10ml pH7.2，5.0mmol/L磷酸盐缓冲液（含0.1mol/LEDTA），离心取上清液，过柱（4.0cmX65cm ),用同样含有10-4mol/LEDTA的磷酸盐缓冲液洗脱，色谱图如图3-13-35所示。经过SephadexG-25分离后，大致可分为两部分，即第一洗脱的大分子蛋白质和第二洗脱的小分子多肽。后者用于提取激肽增强因子，前者收集的溶液合并进一步纯化。

DE-11纤维素柱层析将上述合并液直接上样至预先用pH7.2、5.0mmol/L膦酸缓冲液平衡过的DE-11层析柱（4.0crnX95Cm），然后用不同浓度用相同的磷酸盐缓冲液对氯化钠进行分级洗脱。收集第一个蛋白峰（No.1550）用于制备磷脂酶A2。具有精氨酸酯酶活性的峰，通过生物学活性鉴定，第一和第二酯酶峰是激肽释放酶，但混有凝血酶样活性。第三个酯酶峰呈凝血酶样（No.110124），突触前神经毒素位于其后（No.127163），如图3-13-36所示。洗脱液分别合并，蒸馏水透析，冷冻干燥备用。

DE-52层析：取上述凝血酶级分冻干品100mg溶于10ml pH 8.0、5.0mmol/L磷酸盐缓冲液中，DE-52纤维素柱(1.5cm14cm)用相同的缓冲区。上样后，样品用不同浓度的线性梯度NaCl 洗脱。色谱图如图3-13-37 所示。精氨酸酯酶活性测定显示一个主峰和两个小峰。主峰是凝血酶样成分。随后的杂蛋白峰呈黄色，很可能是含有核黄素辅基的L-氨基酸氧化酶。结合酯酶活性的主峰部分用饱和硫酸铵反透析沉淀，收集沉淀用pH8.0，5.0mmol/L的磷酸盐缓冲液透析平衡，在DE-52纤维素柱上重新层析一次，可以再次去除一些杂蛋白，如图3-13-38所示。

SephadexG-75凝胶过滤将上述纯化的类凝血酶20mg溶解于1ml0.2mol/LNa-Cl、0.02mol/LNaHCO3中，上SephadexG-75柱(1.3cm150cm)上样品，以及用同样的溶液洗脱，可以得到一个对称的蛋白峰，如图3-13-39所示。与精氨酸酯酶的活性峰重合。生物活性测定表明，它可以凝固纤维蛋白原，这是纯化的Agkistrodon 毒液样凝血酶。

纯化的凝血酶样酶在7.5% 或10% 浓度下在聚丙烯酰胺凝胶电泳上显示一条带。糖蛋白用高碘酸-希夫氏试剂染色也可得到一条粉红色条带，与蛋白条带位于同一位置，说明蕲蛇毒凝血酶是一种糖蛋白。

11. X因子激活剂的分离纯化

蛇毒含有X 因子激活剂，但分布并不广泛。在这里，我们介绍了Helene Hofmann 等人从Agkistrodon 毒液中分离因子X 激活剂的过程。 （1987）。将DEAE-Cellulose 色谱矛头(5 m mr) 蛇毒溶解在pH 7.5、10 mM Tris-HCl 缓冲液（含5 mmol/L 苯甲脒）中并透析至溶液中。透析后的样品置于DEAE-Cellulose柱上，用0mol/L0.2mol/LNaCl的线性梯度洗脱。

用50mmol/LTris-HCl缓冲液（含100mmol/LNaCl和5mmol/L苯甲脒）平衡，用该缓冲液洗脱，41操作，流速8ml/h。如图3-13-40和图3-13-3所示。 DEAE-Cellulose 柱层析将图3-13-38 和图3-13-39 中含有Factor X activator 的组分合并，分别上DEAE-Cellulose 柱，得到纯的Factor X Activator 蛋白。

12. 凝血酶原激活剂的纯化

一些蛇毒含有凝血酶激活剂，包括蛇毒蛇的毒液。在这里介绍

弗雷德里克等人。 (1980) 从大盘蛇毒液中分离纯化凝血酶活化剂的工艺。

Ultrogel-22层析法提取100mg大班蛇（

3ml pH5.8，0.05mol/L NaAc（含0.15mol/LNaCl），置于Ultrogel-22柱（1.5cmX100cm）22，每管收集2.5ml馏分，见图3-13-42。

QAE-Sephadex-Q50层析第一步分离第3545位

管收集，上QAE-Sephadex-Q50 柱（0.9cmX

30 厘米）。柱子用pH5.8、0.05mol/L NaAc 缓冲液（含0.15mol/LNaCl）和0.15mol/L 平衡

十三、血小板聚集诱导因子的分离纯化

有些蛇毒组分可以诱导血小板的聚集和释放，而有些能够抑制这种反应。血小板聚集 激活因子可以分为两类：①具有酰胺水解活性的丝氨酸蛋白酶，如从矛头蝮

/.& 'Y-i.

(Soi/iro/^ aimr)蛇毒中分离出的血小板素和从响尾蛇(Crota/奶 Aorr/

1.Sephadex G-75 柱层析用 pH7. 2,0. Olmol/L 碳酸铵缓冲液平衡 Sephadex G-75 柱(柱体积600ml)，用同样溶液溶解0.6g粗毒，离心除去沉淀后上柱。用平衡液在4°C 条件下洗脱，流速36ml/h，每6ml收集一管，如图3-13-44所示。

脱条件在代进行，流速20ml/h，每4ml —管分部收集，如图3-13-45。

3. Sephadex G-75和Sephacryl S-300柱层析收集          第二次层析后的4峰〜6峰，冷 冻干燥，然后先上经pH7. 2,5. Ommol/L碳酸铵缓冲液平衡后的Sephadex G-75柱(柱体 积100ml)，用平衡液洗脱，每管2ml分部收集，见图3-13-46左。把主要峰进一步进行两 次Sephacryl S-300柱层析，所用条件和          第一步相同，每管lml分部收集，见图3-13-46中 和图3-13-46右„