蛇毒蛋白分离技术蛋白质纯化方案

1. 测量方法的建立

在蛋白质的纯化中，70%以上是酶的纯化，因此蛋白质测定方法的建立往往就是酶测定方法的建立。一种有用的酶测定方法必须满足四个标准： 绝对特异性； 灵敏度高； 精度高； 经济简单。虽然通常需要在这些标准之间做出一些妥协，但应该强调的是，放弃任何实质性要求会严重限制检测的一般应用。任何测定的一个基本要求是其特异性，并且由于大多数酶测定检测底物的减少或产物的增加，因此必须注意确保只有一种酶活性与被检测的效果相关。例如磷酸烯醇丙酮酸(PEP) 羧激酶的测定。该酶催化以下反应：

PEP+C02+GDP=OAA+GTP

如果通过测量PEP的减少或OAA（草酰乙酸）的产生来确定酶的活性，则可能会出现较大的误差，除非证明以下酶活性不存在。例如：

PEP羧化酶：PEP+HC03--»OAA+Pi

丙酮酸激酶：PEP+ADP——丙酮酸+ATP

PEP羧基转磷酸酶：PEP+C02+Pi——OAA+PPi

这些问题在纯化的初始阶段特别敏感，此时可能存在任何反应所需的任何底物。通过研究每种情况下的辅助因子要求和产品鉴定，最有说服力地确定了测定的特异性，因为几乎任何酶都可以给出类似的例子，我们必须知道可能导致产品积累或产品积累的各种可能反应底物的利用。

在纯化的初始阶段，大多数酶的活性很低，因此检测方法必须高度灵敏。随着纯化过程的进行，对灵敏度的绝对需求会降低，但在不敏感的方法中用于进行测定的酶量越大，就越不适合用于其他目的。

酶测定的准确度和精密度通常取决于所采用技术的化学基础。例如，如果涉及酶促形成的醛与苯肼反应生成苯腙的测定是在pH 值不合适的缓冲液中进行的，即在pH 显着大于6 的情况下，观察到的苯腙形成速率不会准确地反映了酶催产生醛的速率，但反映了化学反应形成苯腙的速率。测定的准确度反映了测定值与真值的接近程度，而精密度则反映了同一样品在两次或三次测定中的分散程度。例如，如果进行10 次测定且实验值在平均值的5% 以内，则该测定对于检测远低于20% 的变异没有什么价值。比色测定方法特别容易出现这个问题。

最后，还有一点需要考虑的是所采用的测量方法应该是经济可行的。在纯化过程中，必须在每个步骤后跟踪和检查纯化酶的活性。跟踪检查的方法简单，多能表明测得的酶活性与实际活性接近。

蛋白纯化材料的选择非常重要。选材好，工作进度快，效果好；高尚银教授根据他半个世纪的病毒研究经验提出：科研成功的三大因素，即材料、技术和人员。可见研究材料选择的重要性。研究人员可能有也可能没有选择要纯化的分子来源的自由。如果目的是大量获取某种蛋白质来研究蛋白质本身，或者用于其他研究，那么任意选择的可能性就很大。如果纯化的目的是研究系统中的特定组件，则选择来源的自由是有限的。无论哪种情况，都应考虑如何加快纯化过程。纯化本质上是一个浓缩过程，待分离蛋白被浓缩，而其他细胞蛋白未被浓缩，因此当待分离蛋白占细胞总蛋白的比例增加时，纯化就容易了。选择好的酶源的关键是数量。应寻找含有大量待分离蛋白质且易于大量获得的组织。这方面的首选是牛、猪、山羊等大型家畜的器官，另一个来源是微生物。酵母菌、细菌等许多微生物容易生长或价格低廉，很容易以低价大量购买。