蛇毒作用于磷酸酯的酶

(1) 核酸内切酶

检测方法：

取底物3ml（含小牛胸腺DNA 0.04mg，用0.2mol/L pH5.0醋酸钠缓冲液配制）和酶1ml（约20mg蛇毒），置于37保温的分光光度计比色皿中，用水为空白，底物为对照，A26。交替测量和记录胃和A33tom，直到A33teni处的值开始明显增加，然后将A2_m的测量值随时间作图。如果没有获得足够的点来确定直线，则A33Qmn 处的值将显着增加，并且必须用更稀释的毒液再次测量。使用1:75~1:110的稀释剂一般可以获得满意的结果，因为在此条件下，A33_的值可以在1h~2h内保持相对稳定。一个酶单位的核酸内切酶定义为在1分钟内使260nm处的吸光度值增加1所需要的酶量。

(2) 磷酸二酯酶

方法一（Bjork 等人，1963 年）

原理：双对硝基苯磷酸钙经磷酸二酯酶水解生成对硝基苯磷酸，碱性条件下在400nm处有吸收峰。

:反应液含有1.0ml 0.1mol/L Tris-HCl pH8.9缓冲液、1.2ml 0.001mol/L双对硝基苯基磷酸钙和0.2ml酶溶液，加水定容至3ml，37保温。孵育一定时间后，加入3ml 0.05mol/L NaOH终止反应，测定400nm处的吸光度，以不加酶液为对照。每分钟释放1/mL对硝基苯酚的酶活性定义为1个酶单位。

2. 方法二（贝森，1946）

反应体系组成如下：5mg/ml蛇毒溶液配以0.2ml含1.210mol/LMgCl2的0.05mol/L甘氨酸缓冲溶液(pH8.8)。

双对硝基苯磷酸二钠或双对硝基苯磷酸钙（混合于上述溶液中，调pH至8.8）1.0ml，总反应体积1.2ml。 37孵育5min40min后，加入10ml 0.02mol/L NaOH终止反应，420nm比色法测定对硝基苯酚的生成量。

3. 方法三(Razzell, 1963)

该方法与上述两种方法类似，只是用对硝基苯基胸苷5'-磷酸盐代替双对硝基苯基磷酸钙作为底物。反应液含100fxmol Tris-HCl缓冲液，pH 8.9，0.5/xmol底物，总体积为1ml。加入待测溶液前，将混合液置于37水浴中平衡，加入酶液后立即在400nm处测定吸光度值。每分钟水解ljumol 底物相当于1.2 个酶活性单位。

(3) 核酸酶

方法1（Hepper 方法，1955 年）

5'-核苷酸酶、腺苷三磷酸酶、腺磷酸酶和核苷焦磷酸酶的活性均可用Hepper法测定。反应体系组成如下：5mg/ml15mg/ml蛇毒溶液[装于0.05mol/L甘氨酸缓冲液0.2ml(pH8.8)含1.210 mol/LMgCl]、3.610 mol/L5 '-UMP，或ATP，或ADP，或辅酶I（用上述缓冲液配制，调pH至8.8）1.0ml，总反应体积为1.2ml。 37孵育2小时后，加入1ml 10%三氯乙酸终止反应，静置20min，过滤，取滤液1ml按Fiske-Subbarrow法测定无机磷生成量（ 1956), 并在660nm 处测量颜色。

方法2（铃木方法，1958 年）

反应液含0.1ml4;xmol5'-AMP、0.1ml0.3mol/LMgCl2、0.5ml0.2mol/L甘氨酸-NaOH缓冲液(PH8.5)和0.2ml酶液，总体积为0.9ml。 37孵育15min，释放的无机磷用Allend法（1940）测定。

5'-核苷酸酶活性测定除上述方法外，还可采用下列方法： 纸层析法测定底物水解产生的腺苷的放射性。该方法需要对底物腺苷酸AMP 进行放射性标记(Murray et al. 1969)； 在腺苷脱氨酶存在下，用分光光度计测定腺苷转化为肌苷的速率（Ipata，1967）； 也可以测量中的氨(Belfield et al. 1970; Bootsma, 1972)； 用14C标记AMP，酶作用后的反应液过氧化到氧化铝柱上，分离出的“C腺苷”进行放射性测定，未受影响的底物吸附到柱上。

(4)酸性磷酸酶

测定方法(Tu et al. 1966) :

这种方法建立在H0fstee (1954) 的工作之上。向控制管和测量管中加入0.5 ml 0.0036 mol/L 邻羟基苯基磷酸。向对照管中加入0.15mol/L pH5.0的醋酸钠缓冲溶液2.0ml和去离子水0.5ml，总体积为3.0ml。这样终底物浓度为0.6mmol/L，缓冲液浓度为0.1mol/L，量管用0.5ml酶液代替去离子水，酶液混匀后，25孵育，并确定由于水解会释放水杨酸。在300 nm 处产生光吸收。通过调整蛇毒的浓度，将每个测量值和时间绘制在5分钟以内至少可以得到一条直线。每分钟水解1/umol底物所需的酶量定义为1酶单位。

(5) 碱性磷酸酶

1. 方法1 (Sulkowski et al. 1971)

以磷酸对硝基苯酯为底物，该物质不被5'-核苷酸酶水解，从而避免了该酶对试验的干扰。反应液含1.0ml0.lmol

001mol/L 对硝基苯磷酸，0. 3ml 1. 2Xl(T2mol/L MgCl2 和 0. lml 酶液，加水至 3.0ml。 在37°C下反应15min，加3. OmI 0. 05mol/L NaOH停止反应，在400nm处以不加酶的样 品为对照测光吸收。把每分钟释放1/^nol对硝基苯酚的酶量定为1个酶单位。

除上述方法外，碱性磷酸酶还可以用测定磷酸二酯酶活性的Bessey法测定。

方法二

参考 Sigma 改良法及 Bessey 法进行。0. 2% PNPP(pH10. 3,含 Mg2+0. 0025mol/L) lml，酶液 0. 2ml，保温 25min(37°C)。加 10ml 0. 02mol/L NaOH 终止反应。415nm 比色。 查对-硝基酚标准曲线并计算酶活力，每个AKP活力单位是上述条件下每分钟使底物水 解生成l^g分子对-硝基酚的酶活力。

方法三(AKP同工酶的分离鉴定及其等电点测定）

参照乔克强、Coopei.及Gabrie的方法进行。用7. 5%聚丙烯酰胺凝胶做支持物，1% (终浓度)的PH14〜10 Ampholine做两性电解质载体进行等电点聚焦电泳。电泳结束后 取出凝胶，将之置于蒸馏水中漂洗片刻，然后浸泡于酶染液内在37°C水浴中保温30min。 不经漂洗酶带即清楚出现。酶染液组成:在含有25mmol/L a-萘酯磷酸钠的33mmol/L pH8.5Tris-HCl缓冲液中按2mg/ml〜3mg/ml加入G.B. C.，充分搅匀后使用。凝胶各 节段pH值的确定:在同一条件下完成等电聚焦电泳的多条凝胶中抽取部分进行酶染色， 部分凝胶则从正极到负极端按每段0. 5cm切断。依次把各节段置于2ml中性蒸馏水中浸 泡过夜，测定各节段浸泡液的pH值，并据此绘出整条凝胶从正极到负极端的pH递变图。 根据酶带的位置求出各酶带(同工酶)的等电点。

(六）核糖核酸酶

检测方法(McDonald 法，1955):

反应系统组成如下：5mg/ml〜8mg/ml蛇毒溶液（配在0. lmol/L Tris-HCl缓冲液 中，pH7. 6)0.2ml，1.0ml 7mg/ml酵母RNA溶液（配在上述缓冲液中），反应总体积

2ml。在3(TC保温30min以后，加2. 0ml MacFadyeri试剂停止反应，放置30min，过滤， 取1.0ml滤液加1.0ml蒸馏水和6. 0ml 0.2% 3,5-二羟甲苯溶液，在沸水浴中加热 20min显色，在680nm比色，测定寡核苷酸的生成量。

作用于磷酸酯的酶类水解底物有交叉现象，因此在测定过程中一定要注意其他磷酸 酯酶的干扰。例如核酸内切酶、磷酸二酯酶相互间可以产生干扰。5'-核苷酸酶可以干扰磷 酸二酯酶的测定。在实验过程中可以通过选择特定底物、特定反应条件等来避免干扰。

(七）对氧磷酶

检测方法(Mende等，1975):

反应液含0.1ml酶液，50u1 0. lmol/L对氧磷溶液（溶于丙撑二醇）和0.85ml 50mmol/L pH7.4的Tris-HCl缓冲液（含5mmol/L CaCl2)，整个反应体系总体积为0ml。在400nm或348nm处记录消光值来测定水解速度(Armstrong等，I%6)。每分钟 释放lMm0l对-硝基苯酚的酶量定为1个酶单位。