蛇毒对血小板聚集的抑制作用

与血小板聚集诱导因子相比，血小板聚集抑制剂的研究较少。根据现有资料，大部分具有抑制作用的因子都具有PLA2活性；部分具有ADPase活性，少部分具有蛋白酶活性。下面就比较典型的抑制剂做一些介绍。

蛇毒具有促进和抑制血小板聚集的双重作用。活性成分分别为PLA2和核苷酸酶。前者具有诱导血小板聚集的作用，还具有纤维蛋白原溶解活性。 V-核苷酸酶为单肽链，经SDS-PAGE法测定为纯蛋白质，分子量74000，对热稳定，含有589个氨基酸残基。该蛋白可水解ADP和AMP，活性分别为1018/_igPi/mg.min和50428fig/mg.min。酶ADP保温，ADP分解成腺苷，酶活性可被EDTA抑制，Zn2+和Ca2+可解除EDTA的抑制作用。以兔富血小板血浆为原料，该酶可抑制ADP(2.OXl0-5mg/ml)、花生四烯酸钠(100umol/L)、胶原蛋白(20fxg/ml)和低浓度凝血酶和IonophoreA-诱导血小板23187 (5fmiol/L) 引起的聚集，其中胶原蛋白和IonophoreA-23187 诱导的抑制不太明显。这种酶的作用不会引起乳酸脱氢酶的释放。这意味着酶不会导致血小板破裂。对于富含血小板的血浆，5'-核苷酸酶能更好地发挥其酶促活性。帕克汉姆等人。 (1969)发现ADP在血浆中水解为AMP和腺苷，而在无血浆血小板悬液中，ADP主要转化为AMP。腺苷还有抑制血小板聚集的作用。血小板悬浮液含有少量纤维蛋白原，它是ADP 诱导的血小板聚集的辅助因子。 ADP 发挥作用需要纤维蛋白原与血小板膜的结合。简而言之，5'-核苷酸酶抑制血小板聚集就是去除能引起其聚集的ADP，使其积累腺苷，腺苷可抑制血小板聚集。

在蛇毒的分离纯组分（ADPase 5'-核苷酸酶、PLA2 和纤维蛋白原）中，只有ADPase (5 g/ml-100g/ml) 对血小板聚集有积极作用。抑制作用强。能抑制ADP(1(Vm0l/L)胶原蛋白(10^g/ml)和花生四烯酸钠对兔富血小板血浆的诱导作用。5'-核苷酸酶对ADP诱导的血小板聚集有一定的抑制作用。作用。抑制率为314% (n=4P0.05)。纤维蛋白原酶（峰I 和K）在浓度为100pg/ml 时，对上述三种物质诱导的血小板聚集无明显影响。但是，如果纤维蛋白原酶被与富血小板血浆预孵育30min，可抑制ADP(KVM)和胶原蛋白(10^g/ml)引起的血小板聚集，抑制率分别为356%(n=4P0.05) ) 和34 9% (n=4P0.05)。PLA2 (100ng/ml) 不影响血小板聚集。ADPase 是分子量为94000 的单链蛋白，活性为4.3 frniolPi/mg.min，它既有磷酸二酯酶又有弱的5'-核苷酸酶活性，如前所述，从蛇毒中分离出的5'-核苷酸酶只能对ADP诱导的血小板聚集产生轻微的抑制作用，它不同于从蛇毒中分离出的5-核酸酶毒蛇，后者含有低浓度的胶原蛋白（20/ug/ml），花生四烯酸钠（100fmiol/L）或凝血酶（0.05IU/ml）对血小板聚集有很强的抑制作用。这可能是因为从蕲蛇毒液中分离出的5'-核苷酸酶几乎没有水解ADP的活性，而从蛇毒中分离出的5'-核苷酸酶5'-核苷酸酶具有这种活性。了解ADPase 和5'-Nucleotidase 之间的区别和联系非常重要。 ADPase一般只特异性水解ADP，其他核核苷酸没有或很少水解；和5'-核苷酸酶具有广泛的底物范围。 ADP属于5'-核苷酸类化合物，但不同来源的5'-核苷酸酶的水解底物如蛇毒和蛇毒中分离的5'-核酸酶对ADP的水解活性有很大差异。一般来说，ADP酶都是血小板聚集的抑制剂，因为它们都能水解能聚集的ADP；而5'-核苷酸酶只有在能水解更多的ADP时才能表现出抗聚集作用。

从白花蛇毒和铁头蛇毒液中分离出的-纤维蛋白原水解酶对兔血小板悬液显示出抑制血小板聚集的作用。从Agkistrodon毒液中分离出的-纤维蛋白原水解酶可以轻微抑制胶原蛋白和ADP诱导的血小板聚集。其中第一个峰的-纤维蛋白原酶直接作用，不需要预先与血小板孵育；但XI峰的-纤维蛋白原酶如果提前与血小板孵育则抑制作用更强。从蛇毒中分离出的-纤维蛋白原酶与从蛇毒中分离出的-纤维蛋白原酶的K峰具有相似的水解特异性。但前者的抑制作用强于后者。已知纤维蛋白原在各种诱导剂诱导的血小板聚集过程中起重要作用，包括ADP、凝血酶等。有人认为蛇毒中的-纤维蛋白原酶会水解纤维蛋白原与血小板膜受体结合相关的肽键，从而干扰纤维蛋白原与受体的相互作用。

许多血小板聚集抑制剂具有PLA2 活性。如前所述，导致血小板聚集的途径主要有3条：ADP的释放、血栓烷CTXA2的形成、血小板活化因子（PAF）的作用。在凝血恶烷形成过程中，血小板膜磷脂首先由PLA2A释放出花生四烯酸（AA），然后在环加氧酶和凝血恶烷合酶的作用下产生凝血恶烷，从而诱导血小板聚集。血小板活化因子并不预先存在于组织或细胞中，而是在某些能激活细胞内PLA2的物质的诱导下形成的。可见细胞内PLA2在血小板聚集中占有非常重要的地位。然而，一些蛇毒PLA2 是血小板聚集的抑制剂。蛇毒PLA2抑制血小板聚集的作用

Ouyang等（1983)从蝮蛇蛇毒中分离出一种可以抑制血小板聚 集的因子，该因子为一条单链肽，分子量为14 000,具有PLA2活性,属于酸性蛋白。它对 血小板聚集的抑制活性在pH为5. 5条件下9CTC处理30mm仍然存在，但PLA2活性是 热敏感的。它能抑制凝血酶、花生四烯酸钠、胶原蛋白和ionophore A-23187诱导的血小 板聚集，抑制的强度与所用剂量相关。研究结果表明，该因子的抑制作用与自身PLA2活 性无关，由于这种PLA2不具有ADP酶或5'-核苷酸酶的活性，因此认为它的作用与破坏 释放的ADP无关。Huang等(1984)进一步对如蛇毒中PLA2的作用机制 进行研究。他们发现这种PLA2其酶活性可以被p-巯基乙醇破坏，对-溴苯甲酰甲基溴能 够使酶活丧失，但抑制剂对血小板聚集的抑制作用不受影响。EGTA不影响抑制作用。 Ca2+内流可以激活血小板PLA2，也可以引起5-羟色胺的释放，Ca2+的这种激活作用不被 这种PLA2抑制。Huang等(1984)的试验表明：从蛇毒中纯化的血小板聚集抑制剂不影响 血栓素的代谢产物——丙二酰二乙醛的形成。它们的作用也不是以增强前利环素来抑制 血栓素的生成;血小板活化因子诱导血小板聚集需要细胞外Ca2+、丝氨酸酯酶的活化作 用和细胞内Ca2+的动员，而蛇毒PLA2作为血小板聚集的抑制剂并不降低Ca2+流量和细 胞内Ca2+的动员，并不影响血小板活化因子途径的作用;蛇毒PLA2血小板聚集抑制剂并 非与酶的底物(磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇等)产生拮抗作用，因而并不破坏 血小板膜，从而表明它们与磷脂的结合对于拮抗血小板活性并不重要。鉴于以上证据， Huang等认为:①只有少数蛇毒酸性PLA2是血小板聚集的抑制剂，而且这些蛇毒PLA2 对血小板聚集的抑制作用不能用它们的酶活性来解释。因为用BPB修饰了 PLA2活性中 心的His48残基后，酶活性完全丧失但不影响抑制血小板的聚集作用。②由ADP、凝血酶、 花生四烯酸、胶原蛋白等诱导血小板聚集时，蛇毒PLA2是非竞争性抑制剂，与这几种诱 导物质无关。从蛇毒中分离的PLA2在抑制血小板聚集的同时还能抑制血小板 凝块的收缩，这种现象可能与它作用于血小板肌动球蛋白有关。人血小板中含有原丝蛋白 (Profilin)，它结合球状肌动蛋白(G-actin)并且抑制聚合作用。当血小板受聚集诱导剂激 活后，血小板内pH可能改变以及发生形态的变化，生成纤维状肌动蛋白聚合体(F-actin polymer)。蛇毒PLA2血小板聚集抑制剂并不抑制纤维状蛋白的形成，而是在形成纤维状 蛋白聚合体之后，干扰细胞内血小板膜之间的结合而达到抑制血小板的聚集作用，或是起 到干扰a-辅肌动蛋白（a-actinin)与受体的结合。鉴于蛇毒PLA2血小板聚集抑制剂同时 能抑制血凝块的收缩，因此，推测它们可能是抑制血小板肌动球蛋白系统。完整的作用模 式仍有待进一步阐明。

Li等（1985)从圆斑蜂泰国亚种蛇毒中分离出一.种PLA2 血小板功能抑制因子，该因子可以抑制由ADP、肾上腺素、胶原蛋白或凝血酶引起的人血 小板聚集。对蛇毒进行加热处理可以降低PLA2活性和抗血小板聚集活性，但两种活性的 降低是不平行的。这种PLA2对血小板凝块的收缩有较强的抑制作用，抑制作用的强弱与 剂量大小有关。PLA2作用后，由凝血酶刺激形成的丙二酰二乙醛水平没有影响，说明它 的作用机制与蛇毒中分离的PLA2相似，不是以增强前列环素来抑制 血栓素的生成。这种PLA2能使血小板中cAMP的水平升高，而cGMP的水平却有较小 的下降，这种作用不依赖所用剂量的大小而改变。cAMP可以通过如下途径抑制血小板的 功能:①通过激活高密度管状系统内的Ca2+-ATP酶使细胞质内Ca2+浓度降低。②抑制 花生四烯酸和血小板激活因子从血小板膜磷脂中释放。③抑制血栓素对血小板的激活作 用而不影响血栓素A2的合成。④与血小板内微管结合，从而抑制微管的聚集。用显微镜 观察发现，从蛇毒中分离的PLA2作用血小板后其“细胞”骨架发生 变化，血小板失去原来的盘状结构，正常由ADP诱导的血小板聚集所产生的变化也被阻 止。

有关具有抑制血小板聚集功能的pla2还有很多，这里不一一介绍。尽管它们的作用 机制千差万别，但有一点比较肯定，就是它们的抑制功能与自身酶的活性关系不大。不少 人发现它们抑制血小板聚集和血小板凝块收缩作用与它们抑制肌动球蛋白系统以及微丝 -微管系统有关。