蛇毒中作用于磷酸酯的酶-我要创富网

蛇毒中作用于磷酸酯的酶

蛇毒中至少含有四种作用于磷酸酯的酶，它们是核酸内切酶、磷酸二酯酶、5'-核苷酸酶和非特异性单酯酶。这四种酶分布广泛，常同时存在，但含量不同。国外很多学者报道ATP酶独立存在于蛇毒中。中国魏琦等。 (1981)还用广西眼镜王蛇(0.)毒液、眼镜蛇(iV.测定表明ATPase和ADPase独立存在于蛇毒中。但由于蛇毒中的磷酸二酯酶也具有ATPase和ADPase活性，蛇毒具有ATP酶活性的都含有磷酸二酯酶，因此很难说明蛇毒水解成ATP和ADP不是由磷酸二酯酶完成的。Pfeiderer(1963)发现ATP酶活性和磷酸二酯酶活性在纯化过程中是平行的，他们认为ATPase活性是由磷酸二酯酶引起的蛇毒中是否存在ADPase和ATPase，只能通过深入的研究和强有力的证据来解释。

蛇毒中含有的四种磷酸酶在核酸结构分析和基因工程中起着重要作用，是不可或缺的工具酶。这些工具酶需要非常纯净。磷酸酶不能含有其他磷酸酶杂质。即使是微量的杂质也会给实验带来难以克服的困难，所以分离时要特别小心。一般来说，尽量选择酶含量高，其他磷酸酶含量低的蛇毒作为原料。同时，这些酶在分离过程中要相互分离，不能重叠。往往很难达到上述条件。实验中还可以根据四种磷酸酶的不同化学性质对粗毒进行处理，使一些不需要的磷酸酶失活。亲和层析技术的发展和应用为解决此类问题提供了条件。目前，亲和层析已广泛用于制备各种磷酸酶。

1.核酸内切酶

Delezenne 等人。 (1919) 很早就注意到蛇毒可以水解核酸和脱氧核酸，但直到Georgastsos 等人才引起重视。从Agkistrodon 毒液中分离出核酸内切酶。现在已知许多蛇类的毒液中都含有最适pH为5.0的核酸内切酶，例如蕲蛇、蕲蛇、东方小菜蛾（Western Diamondback）、黑颈眼镜蛇（N. nigricollis'）等。

从不同的蛇毒中分离出的核酸内切酶具有不同的特异性，有的能水解DNA，有的能水解RNA，有的能同时水解两者。来自蛇毒的核酸内切酶从用42%丙酮纯化磷酸二酯酶的沉淀副产物中纯化了近1000倍。它能以相似的速率水解DNA 和RNA，最适pH 为5.0，无需Mg2+ 参与。在pH 6.0时稳定，在pH 8.0时最稳定，但在pH 4.0时，在沸水中加热30分钟或4'C放置72小时，50%的酶会失活。从蛇毒中分离出的核酸内切酶作用于DNA时，产物主要为三聚体或多于三聚体的寡核苷酸，寡核苷酸末端为3'-磷酸。反应开始时主要水解DNA中的dGp-Gp键。随着反应的进行，该键的特异性选择性降低，取而代之的是底物链长的选择。最终产物是具有所有四个末端碱基的寡脱氧核苷酸的混合物。从里海眼镜蛇亚种的毒液中分离出一种仅对RNA 具有特异性的核酸内切酶。是一种能被Mg2+激活的酶，分子量15900，对RNA中的碱性基因无选择性，产物为5'-磷酸末端的寡核糖核苷酸，碱基数为260

2.磷酸二酯酶

磷酸二酯酶是多种磷酸酶中的一种重要酶，广泛应用于寡聚核苷酸和多核苷酸序列的测定。该酶以DNA或RNA为底物，但3'端必须有游离羟基。在水解过程中，5'-磷酸单核苷酸从3'-末端开始一个接一个地水解，因此又称为蛇毒核酸外切酶。磷酸二酯酶广泛存在于各科蛇毒中，但这种酶在Cratra属蛇毒中的活性很低，海蛇毒中这种酶的含量也很少。表3-11-2 举例说明了磷酸二酯酶在几个蛇毒家族中的分布。一些蛇毒含有不止一种磷酸二酯酶。例如，从东部小菱形响尾蛇的毒液中分离出三种具有DNA水解活性的磷酸二酯酶，在眼镜蛇OV的毒液中也发现了类似的现象。和Agkistrodon 毒液。从蛇毒中分离出的三种磷酸二酯酶具有相似的稳定性和

最适pH值，但对Mg2+的依赖程度不同，寡脱氧核糖核苷酸和酵母RNA的水解活性也略有不同。

表3-11-2 各种蛇毒中的磷酸二酯酶活性

蛇毒

酶活性

蛇毒

酶活性

响尾蛇

A. bilineatus

刺棘鱼

A. c. moke son

V .r. formosensis

A. p. piscivorus