蛇毒研究中的其他生物学方法

（一）半数致死量（LD5Q）的测定

取小白鼠202g，不分雌雄，分成4组，每组10只，按比例稀释蛇毒。每只小鼠腹腔注射0.2ml，24小时后观察死亡动物数，采用Litchfield和Wilcoxon统计方法计算LD50值。总致死剂量LD:用类似的方法测定，其最小总致死剂量为其中毒剂量LDw。

（2）亚急性毒性试验（秦平等，1986）

该方法普遍适用于连续用药动物可能产生的副作用的检测。本实验以血栓清除酶为例。

选取全系不育雌性大鼠40只，分为5组，每组8只，其中对照组1只，实验组4只。剂量按临床剂量（0.004IU/kg）、1.7倍（0.0069IU/kg）、2.9倍（0.115IU/kg）、5.8倍（0.023IU/kg）、28.8倍（0.115IU/kg） lU/kg) 4组。给药方式为皮下注射，给药时间为临床一个疗程（21天）。该药每天注射一次，体积为1.0ml，按各剂量组稀释后给药，对照组注射生理盐水。各组实验动物观察如下： 日常行为，如摄食量、饮水量、活动状态等； 体重、功能（以尿素氮为指标）、血象检查（血小板、白细胞计数）； 各脏器组织学检查方法为用药21天后将40只大鼠全部处死，对各脏器进行组织学检查，确定毒性损伤的病理形态。以实质器官细胞严重变性、坏死为观察指标，尤其是肝细胞和肾曲曲上皮细胞，其次是心肌成纤维细胞；血管壁和血液毒性损伤的病理形态学判断是根据实质器官的出血情况来观察指标，包括血管周围血液成分和血浆渗出，尤其是肺和肾脏是重点观察的器官，检查肾脏在弯曲管中铸造成型。

(3)药代动力学测定

实验前一天，给兔子的甲状腺灌注高浓度碘化钾溶液，静脉注射1251标记的毒素或成分，然后在不同时间间隔采血，测量辐射强度。注射同位素标记毒素5小时后处死家兔，取每个器官1g测定辐射强度。根据牛顿-高斯法编程，在计算机上拟合血液中的放射性-时间曲线，计算药代动力学模型的参数。从各个器官和组织的放射性强度，我们可以知道进入体内的毒素的分布、代谢和排泄途径。

(4) 血毒素结合动力学的测定

现在有人（魏传宝等，1989）用1251标记出血毒素，研究标记毒素与肾匀浆组织的结合动力学，从而推断出出血毒素在肾脏组织中是否具有特异性作用位点。身体。这些步骤包括：

出血毒素的标记按照Gumaa(1971)的方法，用1251标记从毒物中分离出的出血毒素I(AaHI)，AaHI的量为100Mg。标记后用SephadexG-15分离125I-AaHI和游离1251，洗脱液为0.05mol/L PBS，pH7.4，流速36ml/h，每0.6ml收集1个

管，用FJ-1901Y能谱仪测定放射性强度，收集125I-AaHI试管，3天内用完。

游离1351的测定取收集的125I-AaHI溶液100fxl、兔血清50/xl、15%三氯乙酸200M1沉淀离心，测定上清液的放射性强度。上清液的放射性是由游离1251引起的，游离1251产生的放射性应小于5%。

兔肾匀浆组织的制备用气针将家兔处死，取出肾脏，冷冻至-1CTC，每只肾脏加入

5ml 预冷的（4.0）BufferA，然后在匀浆器上以3000Or/min 的速度匀浆5min。每份肾匀浆组织加入20ml预冷（4）的BufferA，两层纱布过滤，滤液500r/min离心10min，弃上清，沉淀混匀，得肾匀浆组织。其他匀浆组织也以类似的方式制备。

3.结合动力学的测定所有反应体系均含有肾匀浆组织BufferA和125I-AaHI。在测定AaHI 对125 I-AaHI 的竞争结合作用时，反应体系中还含有未标记的AaHI。结合反应完成后，将反应液离心，弃上清，用BufferA洗涤沉淀3次，每次1ml，将洗涤后的沉淀从Eppendorf管中转移至同位素测定管中，使用FJ-1901r光谱仪测量辐射强度，并将数据以曲线的形式表示。该方法可用于测定不同组织与125I-AaHI的结合强度、肾匀浆组织与125I-AaHI结合的时间饱和值、AaHI的浓度饱和值和竞争结合强度。

从125I-AaHI与肾组织结合的时间饱和曲线可知，125I-AaHI的结合作用在1分钟内达到饱和。将不同量的125I-AaHI(s)与一定量的肾脏匀浆组织混合30秒，高速离心终止反应，洗涤后测定辐射强度(v)，作图| vs |，并从曲线中得到显示KD和VMX值。

(5) 疼痛测量法

蛇毒中含有多种能引起疼痛和止痛的成分，因此有必要建立定量的疼痛测量方法。有很多方法可以测量疼痛。这里介绍电刺激鼠尾嘶的方法（尹启章，1979）。蛇毒成分在测量前1 至4 天注射。测量时，先将动物置于特制的固定架上，待动物安静下来后测量基本痛阈值。然后按分组要求按计算出的药量进行微量注射，完成后分别在5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、60分钟分别测一次疼痛。为避免反复过度电刺激对大鼠尾部组织造成损伤，规定最高刺激强度为1.OmA。如果强度达到1.OmA，动物仍不尖叫，则立即停止刺激，并以1.OmA 作为电流阈值。疼痛阈值。镇痛效果用镇痛指数A/表示，

0级一两前爪均匀对称地置于地面,活动无异常；

I级一注射爪轻微接触地面，活动时明显跛行；

I级一注射爪抬起，不接触地面；

I[级一舐咬或摇动注射爪。

实验时，每分钟观察15s，记录该15s内出现的较高痛级，连续观察30min，将记录到 的痛级按时间顺序计算各30min时间段内的痛级的均值，以此作为痛级均数，PIR用以衡 量镇痛效应，PIR越小表示镇痛作用越强。

(六）水肿诱导活性测定

把15g〜18g的小鼠分成若干组，每组4只〜6只，把待测组分或蛇毒溶于生理盐水 内，配制不同浓度溶液。在小鼠后腿的足垫部位进行注射，注射的体积为20/xl，45min后用 断脑法处死小鼠，在踝关节处把双脚切下分别测其重量，由水肿造成的重量增加可以用水

370 中国毒蛇学

肿率来表示。水肿率按下式计算:

   把引起水肿率120%的剂量称为最小水肿剂量。

(七）蛇毒组分金属离子含量的测定

用原子吸收光谱法测定蛇毒组分所含的金属离子种类，以透析液为对照，所有的溶液 都是绝对用无离子水配制的。原子吸收光谱仪——有WYZ- I型光谱仪(中国.沈阳)等。 通常都是测定透析前后样品原子吸收光谱并进行比较，透析液为内含螯合剂的缓冲液(如 Tris-HCl)，一般用邻-菲咯啉作为螯合剂。透析作用在4X：条件下进行72h左右，其间换4 次〜6次透析液。样品中的螯合剂可以用Sephadex G-25柱层析除去。

可以测定除去金属离子后样品的活性，从而可以搞清金属离子在维持活性方面的作 用。

(八）人血小板悬液的制备

在测量蛇毒中血小板功能抑制因子或激活因子时，经常需要血小板，这里介绍血小板 的制备方法：人血液和EDTA轻轻地混合，EDTA的最终浓度为3mmol/L，在90g的条 件下离心lOmin，上清液在500g的条件下离心lOmin，血小板沉淀下来，血小板用不含Ca 的PBS(pH7. 4)洗2次，洗后的血小板悬浮于同样的溶液中。

(九）血小板中环核苷酸的测定

有些血小板功能抑制因子对血小板中cAMP和cGMP的含量产生影响，测定方法如

下：

血小板中cAMP和cGMP的测定按Zhang等(1980,1983)的方法进行，在这里略作 修改。0. 5ml的人血小板悬液和抑制因子混合，在37°C下保温15min，对照用PBS代替抑 制因子。反应完毕后加高氯酸并在80°C温度下加热5min中止反应，然后在1 200g的条件 下离心lOmin，上清液用KOH中和并重新离心，最后上清液在一45°C下贮存。cAMP和 cGMP的含量用放射免疫测定的方法进行，其过程按同位素标记物所附的说明书进行。

(十）回肠纵、环肌标本的制备

用豚鼠25只，体重250g〜350g，兔15只，体重1.5kg〜2kg，雌雄不拘。猛击其头部致 昏后，立即由距回盲部20cm处起，向上截取回肠15cm，用Kreb’s液冲洗干净，制备纵肌 和环肌标本。制备标本按K0SterlitZ(1970)法，把纵肌和肌间神经丛从肠壁上分离下来，称 为分离纵肌标本(实为肌间神经丛纵肌，MPLM)。将肠壁的剩余部分沿环肌走行的方向， 交错对切，切成的肌条即为分离的环肌标本。因该标本内的横向环肌经交错对切后，已改

为纵向对接排列，故便于记录收缩反应。

(十一）环肌收缩反应的记录

将欲对比观察的2个肠肌标本同时安放在一个容积为7ml的浴槽内。浴槽内充满改 良Kreb’s液，通95%02和5%032,恒温37°C。2个标本悬挂在一对铂金电极之间。因2 个标本在同一浴槽内，故药物的作用条件是相同的。2个肠肌标本的收缩反应分别通过2 个换能器输入LM12-YT多道记录仪上，同时记录，观察并对比收缩速度、频率的变化。凡 进行比较的数据均作t检验处理。

(十二)免疫酶标电子显微镜样品的制备(何华平等，1988)

为了确定毒素在体内是否存在特异性结合，免疫酶标电镜法是一种有效的方法，下面 以从A ^⑶加蛇毒中分离的出血毒素I (AaH I )为样品，介绍酶标电镜样品的制备。

家兔致死后迅速解剖腿肌，取一小块立刻投入经液氮预冷的正己烷中，稍后用锋利刀 片将肌块修成约2mmX5mmX7mm小块，控制厚度在25/ini进行冰冻切片，蒸馏水中迅 速展片后捞到载玻片上，放潮湿培养皿中，将经辣根过氧化酶标记的AaH I (简称HRP- AaH I )滴在组织切片上，浸没处理lh后用0. 2mol/L pH7. 2 PB充分漂洗，加入HRP 底物、H202和3,3^二氨基联苯胺四酸盐，显色30min，用0. 2mol/L pH7. 2 PB充分漂洗， 经过常规电镜制片过程，最后在HITACHI 800型分析电镜上观察。

HRP-AaH I用过碘酸氧化法制备(朱培坤等，1983;Nakane等，1974)。反应用5mg HRP 和 5mgAaH I,标记后用 SephadexG-75 把 HRP-AaH I 和游离 AaH I、HRP 分 开，洗脱液为0. 02mol/L PBS(pH7. 2),流速为8ml/h，每2. 5ml收集一管。