蛇毒对血小板聚集的诱导作用

血小板在出血和血栓形成中起重要作用。血栓的形成与止血研究表明，有3条途径导致血小板聚集：ADP释放、血栓素A2（TXA2）形成和血小板活化因子（PAF）。蛇毒可以通过多种方式影响血小板的聚集。有些蛇毒或因子可诱发血小板聚集和释放反应，有些则可抑制这些反应。目前，已从部分蛇毒中分离纯化出血小板活化因子，并对其特性进行了研究。诱导血小板聚集的蛇毒因子可分为两类：第一类是具有酰胺分解活性的丝氨酸蛋白酶，如血小板减少症和响尾蛇血小板素。这两种物质分别是从类蛇蛇和响尾蛇类蛇毒中提取的；第二类是从竹叶青和响尾蛇的蛇毒中提取的非酶成分。此外，还有一些因素会引起血小板聚集，例如某些PLA2和一种叫做Botrocetin的蛋白质。

蛇毒可引起血小板聚集，血小板的形状也随之改变，同时释放出血清素等物质。凝血酶也表现出这种特性，所以初步认为是蛇毒TLE引起的。 Davey和Lcischer（1969）研究了12种具有TLE作用的蛇毒，发现只有6种对血小板有凝集作用，因此认为存在与TLE不同的物质。后来他们从冲绳铁头蛇的毒液中提纯出分子量为4万的血小板聚集因子。它不具有在蛇毒中发现的蛋白酶、精氨酸酯酶、凝血酶和其他酶活性。当血小板聚集时，ADP 被释放，其作用机制尚不清楚。目前，已从各种蛇毒中分离出数百种血小板聚集因子，并对其理化常数和特性进行了大量研究。其中有所谓的第三激活途径的聚集诱导理论，目前研究还不是很清楚，尤其是在分子水平上的研究还不够。

欧阳等。等(1980)从铁头蛇毒液中纯化得到血小板凝集素(简称TMVA)，其分子量为68000，等电点为5.4。并对其性质进行了研究，认为它是第三种激活途径（直接激活）的诱导剂。熊玉良、杨久久、阮长庚等（1987）从铁头蛇毒液中纯化出TM-VA。其分子量为68000，等电点为5.2，与欧阳获得的基本一致。并研究了它对人血小板活化的诱导作用。据信，TMVA 诱导人血小板聚集，伴随着5-羟色胺的释放和血栓素B2（即血栓素A2 的稳定代谢物）的形成。 ADP 清除系统(CP/CPK) 或阿司匹林阻断环氧合酶不能抑制TMVA 诱导的血小板活化。存在纤维蛋白原的TMVA 会诱导用凝血酶处理的脱颗粒血小板聚集。这种TMVA 诱导的血小板聚集与血栓素A2 的释放反应和形成无关。阿地平、川芎嗪和抗人血小板单克隆抗体Sz-2也能阻断人血小板上TMVA和血小板活化因子（PAF）的活化，说明TMVA和PAF可能有共同的活化途径促进血小板活化。

欧阳等。 (1978)发现铁头蛇毒无论有无血浆均可引起血小板聚集，静脉注射可使家兔血小板计数下降10%20%。 Ouyang 等人纯化了该因子。 (1980) 作为非促凝成分。 Che-MingTeng 等人。 (1981)在洗涤的兔血小板和蛇毒中使用血小板聚集诱导因子作用。当诱导因子浓度达到1ug/ml时，90%的血小板可以聚集，40%的血小板因子W可以释放到培养基中；较高浓度的处理可使失去颗粒的血小板经凝血酶处理后聚集，但血小板W因子释放量低于2%。经诱导因子处理后，血小板失去了自身的圆盘状结构，出现不规则的突起，突起中没有细胞颗粒（或细胞器）。细胞颗粒集中在血小板中心，微管在这些细胞器周围形成环状，最后大部分颗粒和高电子密度细胞器消失。血小板受刺激后可释放腺苷酸、Ca2+、5-HT、溶酶体酶和血小板因子，其中腺苷酸（尤其是ADP）是随后血小板聚集的主要介质。血小板W 因子在血小板聚集过程中从颗粒中释放出来，可以进行定量测量。它是定量评价血小板聚集程度的指标，比5-羟色胺等其他因素更为敏感。 60%的血小板因子W储存在血小板中的-颗粒中，40%储存在血小板膜上。 TWwerrww-毒分离出的诱导因子不能释放血小板中的乳酸脱氢酶，所以不会引起血小板破裂，释放的血小板因子必须来自颗粒。与诱导因子孵育6 分钟后，血小板释放了40% 的总血小板IV 因子，消耗了67% 的 颗粒储存量。在聚集的血小板团块中，外侧区域的血小板几乎没有颗粒，而内侧区域的血小板仍有颗粒，只是颗粒比作用前少了。电子显微镜观察发现，血小板聚集的凝块越大，消耗的颗粒和高密度物质就越多。诱导剂的作用与血小板中可释放物质的存在与否无关，但释放可以增强聚集。如果用没有颗粒的血小板作为材料，诱导因子也可以起作用，但浓度要高10倍。血小板中颗粒和高密度物质的释放会加强蛇毒因子对血小板的聚集作用。这两种类型的颗粒的消失伴随着血小板中片状结构的形成。当它们大量释放和聚集时，几乎没有以上两类粒子物质存在。片状结构支配或维持血小板的结构。有研究人员发现，血小板样结构由微管组成，微管系统与外膜相连。他们认为该系统有助于细胞器内可释放物质的分泌。最近的研究发现，在某些情况下，无论血小板是否受到刺激，其中的小管都会在膜外打开。这一发现解释了血小板中的物质如何释放到细胞外。血小板中的微管在维持血小板形态和血小板收缩功能方面起着重要作用。凝血酶、ADP和胶原蛋白可以改变血小板的形状，这与它们能够将周围的微管移动到中心有关。蛇毒的促凝因子也可能以同样的方式改变血小板的形状。从以上研究结果可以看出，ADP和血小板因子W的释放

活性，但能激活血小板使其凝集。由于它能引起动物痉挛，所以称为痉挛毒素。现在还不 清楚它引起白鼠和猫痉挛的原因，有可能是该毒素具有神经毒性，也可能因为在脑血管中 产生微血栓引起。加Ca2+的螯合剂能使血小板凝块解散。Convulxin诱导血小板聚集后其 内的颗粒物消失，这是在聚集作用时被释放所至。被作用的血小板,其内开口于膜的微管 系统也有明显被扰乱的现象,但血小板膜没受什么影响。Convulxin刺激血小板释放ADP 和花生烯酸，后者形成前列腺素和血栓素A2。消除ADP的磷酸肌酸一磷酸肌酸激酶系统 不能抑制由Convulxin诱导的血小板聚集，只能降低其诱导作用。用凝血酶处理使血小板 中的ADP耗尽也不能抵抗Convulxin的诱导作用。消炎痛是前列腺素合成的抑制剂，也 是血栓素A2合成的抑制剂，这可以降低低浓度Convulxin的诱导活性，但高浓度Con- vulxin的作用不受影响。有趣的是消炎痛对低浓度Convlxin作用的抑制作用不因加入能 消除ADP的CP-CPK系统而得到加强。这说明消炎痛仅抑制ADP的释放，ADP消除系 统因而无作用位点。阿斯匹林是前列腺素合成的另一个抑制剂，与消炎痛不同，它不能抑 制由Convulxin诱导的血小板聚集。这一方面说明消炎痛对血小板释放反应的抑制与它 阻断前列腺素合成无关;另一方面说明血栓素的形成与否与Convulxin的诱导作用无关。 由此可见Convulxin可以从血小板中释放出ADP和一种与血栓素A2无关的血小板聚集 诱导物，这种因子被称作“血小板活化因子”，英文名称为“PAF-acether”，与血小板因子4 同类物质。把血小板与过量的凝血酶作用，然后重新使之悬浮和恢复，这时血小板内贮存 的ADP消失，如加外源ADP，仍然能使这类处理后的血小板聚集，但对凝血酶的作用有 抗性。如第一次用Convulxin处理，则第二次用Convulxin处理血小板时作用消失，但它 们却能被凝血酶和5-羟色胺激活。抗性似乎不仅由于颗粒内ADP消耗，而且还有Con- vulxin或凝血酶的作用，可能还涉及到作用的受体等复杂问题。蛇毒中许多作用于纤维蛋 白原的类凝血酶不能引起血小板聚集，凝血酶的诱导作用也不是由于它水解血小板表面 的纤维蛋白原引起。Convulxin的诱导作用与它作用纤维蛋白原无关，由它处理过的血小 板仍能被凝血酶作用。家兔血小板受Convulxin处理再解聚，在不加纤维蛋白原的条件下 ADP就可诱导血小板聚集，而凝血酶处理的血小板则需要加纤维蛋白原才能被ADP作 用。血小板被Convulxin处理后对Convulxin再次处理产生抗性的原因不在于ADP消 耗，因为凝血酶处理后的血小板对Convulxin仍然有作用，而前者内部已无ADP。Con- vulxin对血小板的激活作用可以归纳如下:①Convulxin诱导血小板ADP的释放，但消 除ADP的系统(如CP-CPK)和消耗可释放ADP的物质不能抑制Convulxin的作用；② Convulxin可以加强花生四烯酸的释放和代谢，但能抑制环氧化酶活性的阿斯匹林不能 阻止其作用；③Ccnvulxin的作用机制可能与ADP以及血栓素无关，但与血小板活化因 子的释放关系密切。

Ouyang 等（1984)研究了几种纯化的蛇毒和蜂毒PLA2对洗漆的家兔血小板悬液的作用， 反应系统内无牛血清白蛋白。结果发现蛇毒和 cro巧蛇毒中的3种PLA2能引起血小板的聚集，并有少量5-轻色胺的释放。前2 种来源的PLA2作用有双阶段性，在浓度低于10Mg/ml时，其作用的效果与剂量有关，但 当高于20Mg/ml时，对血小板的聚集作用反而减少，其聚集作用是可逆的。上述是在无牛 血清白蛋白存在下的情况，如把血小板悬于牛血清白蛋白中，他们都没有作用。在这种环境中，这些PLA2只能诱导产生极少量的血栓素B2，几乎可以忽略。从蛇毒和

蛇毒中分离的2种PLA2等电点分别为10. 5和5. 4;从烙铁头蛇毒和棕点竹叶青蛇毒（组分 I、VI、W、XI ) 中分离的PLA2等电点分别为5. 6、10、5. 4、4. 2和3. 6,对血小板的活化作用与它们的酶 的活性以及净电荷无多大关系。经PLA2作用后血小板侧面的表面张力比红细胞大，所以 PLA2对血小板膜的作用比红细胞小。从上述3种毒中分离的PLA2能诱导形成血栓素 B2，产生的多少与所用PLA2的剂量有关。PLA2诱导血小板聚集和血栓素B2的生成能够 平行地被EDTA和消炎痛抑制，用对-溴苯甲酰甲基溴修饰PLA2也能抑制PLA2的上述 作用，其酶的活性也同时消失，因此PLA2可能通过酶的作用水解磷脂，释放花生四烯酸 进而形成血检素。蛇毒中的PLA2(组分I、VI、VI和XH )对血小板 无作用，它们可能属于另一类PLA2，这类PLA2对血水板膜无水解作用。PLA2对血小板 聚集的特异性与它们的底物特异性、对磷脂层的穿透能力以及与血小板膜的接触有关。戊 脉安是Ca2+内流的抑制剂，可以抑制PLA2对血小板聚集的诱导，因此PLA2可能间接引 起Ca2+内流，导致血小板聚集。前列腺素Ei能引起cAMP浓度升高，能够抑制PLA2的 诱导作用。阿的平是内源PLA2激活的抑制剂，也能部分非特异地抑制血栓素B2的生成。 经对-溴苯甲酰甲溴处理的血小板内源PLA2部分失活，但对PLA2反应依然存在，因此 PLA2的作用不是通过激活内源PLA2起作用的。PLA2诱导的血小板形状的改变可以被 EDTA和消炎痛抑制。EDTA和消炎痛几乎彻底抑制PLA2诱导血栓素B2的合成。这说 明由PLA2诱导的血小板形状的改变与血栓素的形成有关。根据对血小板作用的情况不 同可以把蛇毒中的PLA2分成三类:①在无牛血清白蛋白时能诱导家兔血小板的聚集，在 Ca2+存在下对血小板的作用产生双阶段的反应。它们对血小板的激活作用最终与血栓素 的形成有关，这类PLA2从蛇毒(眼镜蛇舟山亚种）蛇毒和铁头)蛇毒中分离的PLA2。②即使在无白蛋白的条件下 也不能诱导血小板的聚集，但也不抑制血小板的聚集。这类PLA2包括从棕点竹叶青和複蛇蛇毒中分离的PLA2。③非聚集性的PL A2。该PLA2对血小板的功能没有明显的影响。这类PLA2包括从Tn+mer削r«s 蛇毒分离的PLA2,它们在血小板悬液中几乎不形成血检素B2。

心脏毒素(CTX)本身不能引起血小板的聚集，但能够加强由ADP、凝血酶、胶原蛋白 和蛇毒PLA2诱导的血小板聚集作用。Teng等(1984)研究了从眼镜蛇舟山亚种蛇毒中分离的心脏毒素的作用方式。该毒不但能加强上述物质对血小板的聚集作 用，还能加强它们对Malondiadehyde合成的诱导作用。这两种作用都可以被消炎痛或 Ca2+抑制。Ca2+浓度在高于5mm0l/L或低于0. 05mmol/L的情况下能抑制其活性。用对 -溴苯甲酰甲溴处理血小板，虽然凝血酶仍可以诱导其聚集，但不能被心脏毒素加强。由凝 血酶和胶原蛋白诱导的血栓素B2形成也可以被该毒素加强，但由花生四烯酸引起的作用 不受影响。从上述实验结果来看，CTX的作用可以是加强血小板膜PLA2的活性，后者加 强花生四烯酸的释放和血栓素A2的合成。血栓素A2使Ca2+内流量增大而引起血小板聚 集。Shier(1979)发现很多培养的细胞内都含有内源的PLA2,其活性可以被蜂毒溶血素 (Melittin)和蛇毒DFP加强。这种作用可以加强3H-花生四烯酸衍生物的释放，后者进一 步转变为其他物质，其中包括前列腺素。CTX的作用与DEP和Melittin可能相似。

具有诱导血小板聚集的蛇毒组分很多，上述的几种是有代表性的，有关其他诱导因子 的作用，读者可参考有关文章。