蛇毒中激肽释放酶

（一、概述

激肽释放酶全称为布雷迪激肽释放酶，又名激肽释放酶。注射响尾蛇毒液的明显作用是降低动物的血压。 RochaeSilva 等人。 (1949)发现蕲蛇毒液能从人体优球蛋白中释放出一种具有生理活性的物质，这种物质称为缓激肽，具有降低血压的作用。由于响尾蛇毒液中蛋白水解酶的活性很高，人们认为激肽原释放激肽是肽链内切酶作用的结果。后来Deutsch 和DiniZ (1955) 报道说蛋白质水解和激肽释放酶活性之间没有确切的关系。 (1957)发现蛇毒即使在100加热3分钟至5分钟后仍保持释放缓激肽和促凝活性。从那以后，激肽释放酶也在哺乳动物的血浆和某些腺体中被发现，分别被称为血浆激肽释放酶和组织激肽释放酶。激肽释放酶在体内具有重要的生理功能。它不仅能释放激肽，还能激活凝血因子XII参与凝血反应，还与补体系统密切相关。激肽释放酶释放的激肽具有强烈的生理作用，如毛细血管松弛、血压下降、平滑肌收缩和疼痛诱导。激肽释放酶和激肽原、激肽和激肽酶共同构成激肽释放酶-激肽系统，认识该系统在理论上和临床医学中的作用具有重要意义。现在已知所有响尾蛇和毒蛇毒液都含有激肽释放酶，一种作用于血浆中的激肽原以释放缓激肽的酶。它们不同于蛇毒中的其他精氨酸酯酶和凝血酶样酶，因为当用合成底物baee、bame 和TAME much 处理时，它们的水解活性低于精氨酸酯酶和凝血酶样酶。 Oshi-ma 等人。等(1969)研究了蝰科、蝰蛇科和眼镜蛇科32种蛇毒的精氨酸酯酶和激肽释放酶活性，指出激肽释放酶在蝰科毒液中活性较高。

(2)分离纯化及理化性质

自1949年Rochae Silva等人首次在美洲矛头蝰蛇(0 ro%jararaca)的毒液中发现激肽释放酶以来，许多学者对从蛇毒中分离激肽释放酶及其理化性质做了大量工作。属性进行了研究。 1965年佐藤等人从日本复合蛇的毒液中分离纯化出激肽释放酶，并对其理化性质进行了研究。过去，激肽释放酶也从以下蛇的毒液中纯化出来：美国长矛头蛇、西部菱纹背响尾蛇、锯鳞毒蛇和加蓬四毒蛇。分离这些蛇毒中的激肽释放酶通常使用DEAE-Cellulose、CM-CellUlOSe或羟基磷灰石重复层析去除破坏激肽和其他精氨酸酯酶的酶。上述蛇毒均含有两种激肽释放酶，可用SephadexG-75或DEAE-Cellulose柱层析分离。两者之间的区别尚不清楚，但其中一种可能具有更小的分子量。

在过去的10年里，蛇毒激肽释放酶发生了多次分离。贝利等人。 (1976) 和Viljoen (1979) 从黄蜂和Gabonus 的毒液中分离出激肽释放酶。杉原等人。 (1981, 1982) 研究了铁头蛇毒液中的激肽释放酶。王新民等。等(1984)发现浙江帕拉斯产的蛇毒中含有激肽释放酶，能水解激肽原释放激肽而不活化，具有弱的精氨酸酯酶活性。粗毒经DEAE-纤维素、DE-22、DE-52和SephadexG-75分离纯化后，可得到激肽释放酶的两个组分：I和I。两者的电泳行为和酶活性不同。 Kallikrein I在聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示一条带，组分I中有少量组分I。Kallikrein I是一种糖蛋白，含糖量为20.3%，约有221个氨基酸残基。经凝胶过滤和SDS电泳测定其分子量分别为31,000和30,000。该酶具有严格的底物特异性，可作用于激肽释放酶的特异性底物Z-Phe-Arg-MCA和Bz-Pro-Phe-Arg-PA，而不作用于一般蛋白质底物酪蛋白，水解率TAME水解速率仅为BAEE的14%，以BAEE为底物时，其最适pH为8~9，Km值为2.8510-4mol/L。当pH值低于5或高于9，温度高于40时，酶活性迅速下降。精氨酸酯酶和激肽释放酶的活性可被丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF和DFP抑制，两者呈平行关系，但均不受胰蛋白酶特异性抑制剂TLCK的抑制。箭头抑制剂和大豆胰蛋白酶抑制剂可以部分抑制这种酶。 Kallikrein I也可用阳离子交换树脂层析如磷酸纤维素或交联箭头抑制剂Sepharose4B亲和层析纯化，但纯化后精氨酸酯酶活性降低，激肽释放酶活性几乎完全丧失。圆二色谱表明酶的构象发生了变化。激肽释放酶I作用于激肽原的产物经鉴定证实为缓激肽。

大谷等。 (1983) 从蛇毒中纯化出一种蛋白酶，这种蛋白酶可能会导致毛细血管通透性增加。从4g粗病毒中可纯化出6.2mg该蛋白酶，纯化后的蛋白在pH 8.3和pH 4.5条件下进行PAGE检测为纯蛋白。该酶无酪蛋白水解活性和凝血活性，但能水解TAME，表明其具有精氨酸酯酶活性。通过将酶Spg 注射到兔子的皮肤中可以发现毛细血管通透性的增加。 O-htaini 等人。 (1985)进一步研究发现，将该酶与牛血浆混合，注入无毛兔背部皮肤。毛细血管通透性的增加大于单独注射酶的增加。混合物（酶和牛血浆）用50%70%乙醇提取后，如果该提取物再用羧肽酶A处理，其活性即丧失，因此认为该酶对毛细血管通透性有作用。增加作用是由于它作用于牛血浆中的某种蛋白质，释放出小分子肽。没有发现组胺和过敏原等其他物质的释放，对补体系统也没有任何影响。大谷等。 (1988) 进一步研究了毛细血管通透性增强因子的物理化学性质。研究表明：通过SDS-PAGE分析该因素

测定时分子量为32 000,由266个氨基酸残基组成，芦一条狀 链，含糖量为11. 4%，等电点为4. 8。这种酶比哺乳动物中丝氨酸型蛋白酶有更^广泛的底 物，能水解精氨酸酯和赖氨酸酯，但水解前种底物的活性较高，它不能水解酪氨酸酯。DFP 可以同时抑制它的精氨酸酯酶和毛细血管通透性增加活性，说明这种酶是以丝氨酸作为 活性中心的丝氨酸蛋白酶。对它的最适pH和热稳定性也作了大致的研究，该酶在pH7〜 9范围内稳定，在5(TC以上酶失去活性。在从九蛇毒中分离出毛细血管通透 性增加因子的同时，Ohtaini等(1988)还从该蛇毒中分离出一种激肽释放酶，在PH8. 3条 件下用PAGE法和SDS-PAGE法测定为纯品。该酶无酪蛋白水解活性和促凝活性，但能 从牛高分子量激肽原中释放出舒缓激肽。把这种蛋白质注入到家兔皮内会增加毛细血管 的通透性。一般认为它的增加毛细血管通透性作用与它的舒缓激肽释放作用有关。对该 酶的物理化学性质进行研究发现，该释放酶是含糖的单链肽，糖的含量为10. 1%，分子量 为33 500,由274个氨基酸残基组成，等电点为3.5。释放酶水解精氨酸酯的速度比水解 赖氨酸酯快，不能水解酪氨酸酯。DFP能抑制它的精氨酸酯酶活性，也能抑制从牛高分子 量激肽原中释放激肽，这说明该酶的活性部位有丝氨酸残基。该酶还能水解PNA,H . D . Phe-Pipecolyl-Arg-PNA、H .Pro-Phe-Arg-PNA、H *D .Val-Leu-Arg-PNA 和 Pro-Phe-Arg-4-Methylcoumary-7-Amide,这说明这种酶的底物比动物中的丝氨酸蛋白 酶更少。

Schwartz等（1985)从Crote/w5蛇毒中分离出两种酶，这两种酶的氨基酸含量相似，都含有糖类，分别称为AAE I和AAE I，它们的最适pH值在 8. 0〜8. 5范围内，都不能水解酪蛋白、血红蛋白和BAPNA，但都能水解BAME、TAME 和Ac-Phe-Arg-OMe。酶的活性可以被丝氨酸修饰剂和苯甲酰胺抑制，但EDTA和大豆 胰蛋白酶抑制剂不抑制其活性。两种酶都无类凝血酶活性，但都能释放激肽，这可以通过 分离的小鼠子宫收缩来证明。AAE I和AAE I的N-端氨基酸顺序相同，而且与从其他响 尾蛇毒中分离出来的精氨酸酯酶相似。

Samel等(1987)从极北蜂(V7/>ct"<2term)蛇毒中分离出两种精氨酸酯水解酶，命名为E I和EI。这两种酶都是由同工酶组成的混合物，E I的等电点在4.0〜4. 6范围 内，£1的等电点在3.3〜3.9范围内。同工酶的分子量相等，用303^八0£测定£1分子 量为38 500，En分子量为41 000。两种酶的N末端氨基酸都为缬氨酸，它们的氨基酸含 量也十分相似，都含有糖类。如用神经氨酸酶处理E I和E I后，两种酶在等电聚焦电泳 系统中的迁移速度相近。这两种酶对酪蛋白和BAPNA都无水解作用，但都能水解 BAEE、TAME和Pro-Phe-Arg-ACA。它们的酯酶活性可以被有机磷和苯甲酰胺抑制，大

豆胰蛋白酶抑制剂也有轻微的抑制作用。E I水解BAEE的Km为3.3X105mol/L，水解 TAME 的 Km 为 3. 0105mol/L，E I 水解 BAEE 和 TAME 的 Km 值为 2. 7X105mol/L 和5. 9X105mol/：UE I具有激肽释放反应，可以引起分离的小鼠子宫收缩。E I的生理作 用还不知道，这两种酯酶均无类凝血酶和纤维蛋白原溶解酶的活性。

Komori等（1988)从毒蝰蛇毒中分离出一种类似于激肽释放酶 的酶，是分子量为43 000的糖蛋白，等电点为4.1。它具有精氨酸酯酶活性，但对二甲酰 酪蛋白或纤维蛋白原无水解活性，与牛血浆作用后的混合物能引起分离的小鼠子宫收缩， 说明它能从牛血浆蛋白中释放激肽。2. 36mg酶在lmin可以释放lfxmol/L舒缓激肽。该 酶还可以引起毛细血管通透性增加，降低血压；以用人工合成的激肽原类似物Ser-Leu- Met-Lys-Arg-Pro-P)"0-Gly-Plie-Ser-Pro-Phe-Arg-Ser-Val-Gly-Val-Ser 为底物时，该酶 可以水解产生舒缓激肽和赖氨酰舒缓激肽，这进一步说明它具有类似激肽释放酶的活性。 该酶对子宫的收缩作用、毛细血管通透作用和精氨酸酯酶活性可以被DFP抑制，这说明 酶中的丝氨酸羟基是酶活性和生物活性必须的。抗凝血酶I、肝素和血浆中发现的丝氨酸 蛋白酶抑制剂对该酶无影响。已经对该酶的N-端氨基酸顺序进行了分析，与其他蛇毒中 的激肽释放酶以及猪胰激肽释放酶的N-端相似。

除上述介绍的以外，Bjarnason等（1983)从西部菱斑响尾蛇(Crota/奶 afmr)蛇毒中， Markland等（1982)从东部菱斑响尾蛇(CVo印蛇毒中，Siigur等（1982)从地 中海蜂蛇毒中分别纯化出了激肽释放酶或类似物，有关它们 的详细情况可查看有关文献。

总的来说，激肽释放酶都比较稳定，在冰冻状态下至少可以稳定保存6个月，冻干过 程中不会影响酶的活性。该酶对热也较稳定，但如用沸水浴加热20min，其活性完全消失。 从加蓬U丝蜂(5to)和银鳞蝰(b can'watos)蛇毒中分离出来的激肽释放酶分子量分别为33 500和22 000。多数激肽释放酶是糖蛋白。对中国浙江蝮蛇Pallas)蛇毒中的激肽释放酶I的氨基酸组成研究发现，它含有丰富的谷氨酸和甘 氨酸，含量较高的是天门冬氨酸，等电点测定也属于酸性蛋白，共含有221个氨基酸残基， 糖含量为20. 3% ,其中中性糖8. 0%，唾液酸1. 8%，氨基己糖为10. 7%。与其他激肽释放 酶相比，它的稳定性要差得多。将激肽酶I分别于不同温度下保温3h，然后测定水解 BAEE的活力，结果表明，激肽释放酶在30°C以下比较稳定，超过40€活力迅速下降。将 激肽释放酶I分别溶于不同pH的0. lmol/L缓冲液中，配成0. 3mg/ml酶液于室温 (25D静置24h后测定水解BAEE活性，结果表明酶在pH5. 0〜9. 0之间稳定，而在 PH5. 0以下或9. 0以上活力则明显下降。这说明这个酶对酸、碱都不稳定，这一点与日本 蝮蛇及哺乳动物组织激肽释放酶相似。

激肽释放酶的最适pH为8. 5〜9. 0,在这种条件下水解BAEE和释放激肽的活性最 强。阳离子(^2+^82+、^[112+、2112+丄£12+和？62+对激肽释放酶的活性无任何影响，但它 可以被DFP和胰脏碱性胰蛋白酶抑制剂抑制。这两种抑制剂不能抑制从加蓬咝蝰(£/沿 蛇毒中分离出来的激肽释放酶。激肽释放酶释放激肽作用可以被合成底物 BAEE、TAME抑制，抑制的程度与这两种底物的浓度有关。