蛇毒蛋白的分离技术凝胶柱层析的方法

(1)凝胶柱的制备

凝胶类型的选择混合物的分离程度主要取决于凝胶颗粒的孔径大小和被分离物质的分子量分布范围，其次还受凝胶交联程度的影响。交联度决定了排除种类的分子量的下限。缓慢移动的小分子物质在低交联度凝胶上不易分离。因此，大分子物质与小分子物质的分离常采用高交联度的凝胶。

凝胶颗粒的粗细直接关系到分离效果。细颗粒的分离效果较好，但流速很慢。因此，在用于大批量生产时，多采用粗颗粒。

凝胶的用量与所用色谱柱的大小有关。一般来说，柱子的直径与高度之比为1:10~1:20。凝胶床的高度取决于分离的性质。例如，当样品脱盐时，流化床可以是样品体积的5 倍。如果被分离物质的分子量比较接近，宜使用细而长的柱子（如1:100或更大），这样可以提高凝胶层析分离的灵敏度，但有时太细的柱子会产生壁面效应值得注意。柱径确定后， 3.凝胶颗粒的水化干凝胶除了用于样品浓缩外，一般需要充分水化。方法是将干凝胶悬浮于510倍量的水或洗脱液中。最好将干胶加入水中，边加边搅拌，防止胶粒凝聚在一起。待干胶完全水化并形成均匀的悬浮液后，置于室温下备用。干凝胶如需快速水化，可将凝胶悬浮于5mol/L6mol/L尿素溶液中，凝胶颗粒迅速溶胀，然后用规定的缓冲液充分洗去尿素。如果凝胶水化不完全，装填后会继续膨胀体积增大，破坏色谱规则，影响分离效果。为避免产生气泡，浸泡胶粒的液体体积不宜过小，水合胶粒在水溶液中会因重力作用下沉，反复洗涤后可用于装柱浇注法连用34次。上清液中有时会漂浮一些细小的胶体颗粒，这是由于凝胶颗粒大小不均所致，倒上清液时可一并弃去。

凝胶柱填充在凝胶色谱中，柱子的大小是根据实验的要求来选择的。一般采用圆柱形玻璃柱或有机玻璃柱，柱底常加一层直径为0.5的层。毫米的小玻璃珠，上面铺一层细玻璃渣作为流化床的支撑。也可用烧结玻璃板或钻有一些小孔的玻璃板覆盖滤纸作为柱床的支撑。当烧结玻璃板用作床的支撑时，很容易被结块的小颗粒堵塞。目前已增加一层尼龙网作为底部柱床的支撑。

入口和出口处的混合室必须尽可能小，这样可以提高色谱的灵敏度。如果下口混合室较大，可以填充小玻璃珠或玻璃丝来弥补。长颈漏斗连接到柱的顶部。装粗柱时，漏斗颈直径约为柱径的一半，通过橡皮塞与柱顶相连。安装细柱时，漏斗颈的直径可选择与柱径相近，两者通过合适的橡胶管连接。漏斗与色谱柱应保持垂直，可用立式钢丝锤校正柱的垂直位置。用水或洗脱液填充漏斗和色谱柱。加液时必须注意将气泡赶出，使支撑筛板底部完全充满液体，然后将柱下口盖紧。如果柱子底部的支撑物是带孔的平板玻璃板时，可从柱子顶部加一块略小于柱子直径并能盖住筛孔的快速滤纸盘柱，漂浮在水中，慢慢下沉，平铺在柱底的筛板上。

(1)W7.5胶体颗粒填充柱的方法：胶体颗粒水化形成悬浮凝胶后，必须去除气泡。在保持实验温度的同时装柱，可以避免实验过程中温度对色谱柱的影响。床缩小或扩大。将凝胶悬液调至适合倾倒的浓度，然后加入漏斗中，使凝胶颗粒逐渐扩散下沉。流化床填充至1cm2cm高度后，打开出液口，保持流速均匀，直至收尾。流速一般为每分钟5ml~10ml。当流床达到一定高度，平衡液高出胶床2cm5cm时，关闭出液口。如需重新加入胶粒，必须在柱内凝胶床顶部轻轻搅拌，使悬浮液均匀。如果在加入胶粒之前不搅拌胶粒，则会产生可见的第二层胶带。发生这种情况时，应重新安装。柱子装满后，用一张滤纸盖住流化床，滤纸的尺寸略小于柱子的内径，以防止样品中的一些不溶性物质混入流化床，和然后用洗脱液平衡色谱柱，直到流出液的离子强度或直到pH 值与洗脱液相同。一般只要出水量超过流化床的体积，基本就平衡了。

将各种型号Sephadex最大压力（kPa）的柱子竖直固定后，在下口接一根长度与柱子长度相近的细管，将平衡液按以上方法，除去气泡，加滤纸，滤纸沉到柱底后，从漏斗中加入悬浮液。 20分钟后，将出液管拉至刚好低于柱顶的高度，打开出液口，保持一定的流速。如果需要填满凝胶床的凝胶在开始时没有完全加入到柱子中，可以在关闭排水管后加入凝胶悬浮液，但凝胶必须均匀悬浮在柱子中。凝胶床液面逐渐升高，无胶带层出现，说明填充均匀，然后逐渐降低柱子出口管，直至达到实验所需的操作压力。不同类型的凝胶具有不同的承受压力的能力。对于孔隙大的，压力过大，胶体颗粒容易变形，影响分离，减慢流速。各种凝胶的最大承压见表3-13-3。例如SephadexG-200的最终操作压力不能大于10cm。如果用泵加压，应注意压力不能过高，否则流速过快，流化床发生变化。 G-25以下各型号凝胶平衡时，一般在流化床上加一定体积的储液瓶（或分液漏斗），用橡皮管密封与柱上口连接，从而产生一定量的静水。水压能满足实验要求。

凝胶柱的检查为了保证凝胶过滤层析的分离效率，在装好柱后检查填充柱的质量是非常必要的。通常用有色物质的溶液（如铁蛋白溶液、墨汁或有色多糖溶液等）流过柱床，检查柱床的均匀性，跟踪有色区通过柱床的过程。柱床来判断填充的质量。如果色带窄、均匀、平坦，说明色谱柱性能好；如果色带扭曲、散乱和变宽，则必须重新填充色谱柱。

凝胶床维护如果凝胶床维护得当，它可以重复使用。凝胶床容易发生微生物腐蚀，必须防止，因为它不仅会影响凝胶的性能，还会影响物质的分离。

(二）加样

为了避免流床的污染，并保持较高的流速，样品中不溶物必须去除干净。可以用过滤 和离心的方法除去，因为如脂类化合物或脂蛋白等能够吸附在胶粒上，会给分离效果带来 不良影响。至于分配等温线是线型的，凝胶过滤显然和样品浓度关系不大，但是，除了溶质 的溶解度外，样品的粘度常常影响到浓度。样品的粘度不宜过大，若样品粘度大，将会形成 较宽的带，可使分离效果减低，蛋白含量一般不能超过4%。样品的体积一般规定在凝胶 床体积的1%〜4%，如初步分离可增加到10%，如为分离蛋白去盐，样品体积可扩大到凝 胶床体积的20%〜30%。但样品体积过大，往往分离效果不理想。加样时将样品用移液管 小心地移入柱的上端，待样品完全移入凝胶内，即加少量洗脱液。

另一种加样品的方法可以缩短加样时间，即在样品中加入适量蔗糖，调节其比重至较 洗脱液为大，如此，不必吸去床上的液体即可直接用吸管加样了。

(三）洗脱

在上样之后，一般就可以开始洗脱了。将洗脱液装入一个下口瓶或分液漏斗中，以橡 皮管与凝胶柱连接，连接处可用玻璃磨口，或橡皮塞闭封。完全不带电荷的物质可用蒸馏 水洗脱，若物质有带电基因，洗脱液离子强度至少要大于0. 02mol/L以获得较好的结果。 因为Sephadex含有少量羧基，会吸附少量的阳离子而排斥少量的阴离子。大多数的物质 从柱床洗脱时是借重力特性流动的，用低W胶粒，流体静压力影响流速甚小，可以适当的 调节洗脱液的流速及洗脱液的高度即可。高W胶粒，须使用低的流体静压力，必须小心控 制，以防止凝胶粒过紧。由于这种原因，要达到一个稳定的流速，应采用一种恒压洗脱装 置。当样品粘度高，流速慢，或要求控制流速十分精确时，可在贮藏瓶上加一恒压供液泵。 洗脱液可用人工或自动收集器按一定重量或体积收集。分部收集后的洗脱液的成分可根 据其不同内容进行测定。例如核酸或蛋白质可直接通过紫外吸收光谱法，糖类、氨基酸等 可以用显色反应测定，同位素标记的物质可以通过比放射性测定之。

(四）凝胶的再生

仅经过一个实验，胶床是不需要再生的。但在长时间使用后，流速会逐渐变慢，这主要 是由于液流把胶床压紧的缘故。用水逆向洗涤或重新填装柱子，流速就可复原。流速降低 有时也会是因灰尘之类沉积在胶床顶部所造成，如果每次实验结束后，把胶床顶部表面一 层的凝胶去掉，再补充一些新的凝胶糊即可防止流速的变化。如果凝胶需要长时间保存 时，还是以干燥成干胶粒后保存为宜。方法是先用水洗去游离的分子，如胶体积很大，可以 用50%的乙醇洗，同时也可起到脱水作用。尽量洗去凝胶粒中的水分，再放在干燥器中抽 干。接近干燥时，再加1倍〜2倍95%乙醇，搅开凝胶块，静置0. 5h〜lh后再不时搅动，这 样反复用乙醇处理4次〜5次，抽干后在烘箱中于6CTC〜8(TC下烘干，密封保存。凝胶脱 水，切忌一开始就用浓乙醇处理，以防凝块。醇洗的浓度应逐渐加大。

(五）影响因素和注意事项

层析柱的准备凝胶层析的成功，在很大程度上决定于柱装的好坏。设计合适的层 析柱有如下几点考虑:死体积(凝胶支持板到柱出口间的空间)要小；用细管连接流出液的 形式要灵活、方便;凝胶床的支持板(常用尼龙筛板)不能被堵塞;还要注意保持床面的一 些措施。

细玻璃球或用加热处理的玻璃筛板不能用作凝胶床的支持板，因为它们能吸附很多 蛋白质。

根据具体情况，选择凝胶类型和柱的大小。用来从大分子(M.W>2 000)中分离小分 子，如无机盐或代谢中间物(M.W<1 500)时，柱床体积应是上样体积的4倍〜10倍，柱 高：柱直径应为5 : 1〜15 : 1,这类柱叫除盐柱。一般使用很小孔径的凝胶，其排阻极限 在25 000以下。相反，用来分离大分子时，柱床体积应为上样体积的25倍〜100倍，柱高 与柱直径之比应为20 : 1〜100 : 1。

直径小(小于lcm)的柱，在湿润的玻璃柱壁上有“壁效应”，即降低靠近柱壁的溶剂的 流动。这个效应是由于壁和沿壁流动的分子间的摩擦力引起的，能严重降低柱的分辨力。 用二甲基二氯硅烷处理柱壁可以克服这个缺点。但这样处理所带来的弊病是可能降低柱的流速。

洗脱剂的离子强度和pH值非水溶性物质的分离，多采用Sephadex-LH，可以用 一种有机溶剂来洗脱。对于水溶性物质的分离，按照被分离物质的性质，选用适宜的洗脱 条件。离子强度和pH值一般对凝胶无多大影响，主要是考虑被分离物质解离、聚合、溶解 度和稳定程度。离子强度的变化对物质分离具有不同的影响，例如洗脱碱性蛋白时，需要 用含有一定浓度的盐的洗脱液洗脱，这样可以随盐浓度的增加而使移动加快，但是等电点 低于pH7. 0的一些蛋白质在分离洗脱时受离子强度的影响甚小。盐类洗脱剂也能控制 Sephadex凝胶的吸附作用，硼酸盐溶液可以与凝胶发生吸附，不宜用此为洗脱剂。pH的 影响和被分离物质的酸碱性质有关，碱性物质易被酸性溶液洗脱，酸性物质易被碱性溶液 洗脱，多糖和核酸之类的物质用水或中性盐溶液洗脱即可。