蛇毒中出血毒素

出血毒素是主要的血液循环毒素，可引起动物水肿、出血和组织坏死。这种毒素广泛存在于蜂蛇毒和响尾蛇毒中。只有眼镜王蛇科的眼镜王蛇蛇毒含有出血毒素，海蛇毒至今未发现有出血毒素。已知响尾蛇毒和毒蛇毒会引起强烈的局部影响，包括水肿、出血和组织坏死，所有这些都与出血性毒素有关。由于局部病变发生迅速，应用抗血清治疗往往来不及治疗，治疗难度大。这种病变常使蛇咬伤患者的肢体坏死，有时不得不截肢，是蛇咬伤治疗中的一大难题。响尾蛇毒和毒蛇毒引起的出血作用因蛇毒和剂量的不同而不同。弱者仅在伤口或注射部位引起少量皮内或皮下出血；严重的会导致伤口或注射部位附近的组织或肌肉大面积出血；严重者不仅伤口或注射部位出血，还会引起内脏器官（如肺、肝、肠等）大面积出血。在这种情况下，血毒素的出血作用是动物死亡的主要原因。

1、分离提纯

由于出血性毒素能引起严重的病理变化，人们对其给予了广泛的关注，但与对神经毒素的认识相比，还是很肤浅的。一方面，由于出血性毒素分子量较大，有的还含有碳水化合物等其他成分，给分离纯化带来一定困难。事实上，出血性毒素的分离纯化只有在现代色谱技术应用于蛋白质分离后才有可能，而神经毒素，尤其是突触后神经毒素，有时只能通过沉淀法进行部分纯化。另一方面，大多数出血毒素不稳定，具有蛋白水解酶活性，在纯化过程中会自动降解，这使得分离出的出血毒素很难非常单一。

以往分离出血性毒素多以以下四种蛇毒为原料：日本白花蛇、美洲白花蛇（Bothrops jararaca）、黄绿铁头蛇（J'rimeresurus flavoviridis）和巴毒蛇。最初从蛇毒中分离出两种出血性毒素，称为HR 和HR2。这两种毒素也是最早从蛇毒中分离出的两种出血性毒素，均具有酪蛋白水解酶活性。后来进一步发现HR2由2种出血毒素组成，通过Bio-Rex70柱层析可以分离出2种出血毒素，分别称为HR2i^HR2b。其实HR2b还是不够纯。最近，Yanaha 等人。进一步纯化HR2b。纯化后的HR21^5经超高速离心和SDS-PAGE确定为纯蛋白。 SephadexG-75和SDS-PAGE测得的分子量分别为18000和18500，表明HR2b为单体蛋白。矢那霸已经得到了HR2b的结晶，这是迄今为止得到的唯一一颗出血毒素的结晶。由于没有得到单晶，所以还没有进行其三维结构的X射线衍射。 HR2a和HR2b都没有蛋白水解酶活性，也没有其他酶活性。大岛等。 (1972)从蛇毒中分离出两种出血因子，分别命名为HR-I和HR-I。 HR-I 既没有蛋白水解活性，也没有其他酶活性； HR-I具有蛋白水解活性，但具有与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶不同的性质，它破坏缓激肽。从蛇毒中仅分离出一种出血性毒素HF2，该毒素具有酪蛋白酶活性。

石窟等。 (1967) 首先从蛇毒中分离出一种酸性出血毒素，后来Ovadia 等人。 (1978) 从中分离出另外两种出血性毒素。现该毒中的三种出血性毒素分别称为HR1、HR2和HR3，HR3无蛋白水解酶活性，HR2具有较强的蛋白水解酶活性。

近年来，在从西部小菜蛾响尾蛇、尖嘴响尾蛇和东部小菜蛾的毒液中分离出出血性毒素方面做了大量工作。在4 种出血性毒素之后，Mori 等人。 (1984) 从毒物中分离出一种出血性毒素，并将其命名为Ac5-蛋白酶。以往分离出的4种出血性毒素分别称为Ac1-蛋白酶、Ac2-蛋白酶、Ac3-蛋白酶、Ac4-蛋白酶。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和pH 4.3 下的SDS-PAGE 确定分离的Ac5-蛋白酶是纯蛋白质。

除Ac4-蛋白酶无致死活性外，其余4种出血性毒素均具有致死活性。 Ac3-蛋白酶含有少量碳水化合物（0.1% W/W），其他4种出血性毒素不含碳水化合物。 EDTA、邻菲咯啉和半胱氨酸可抑制五种出血性毒素的活性。从AC2-蛋白酶到Ac5-蛋白酶，它们的分子量分别为24000、25000、57000、33000和24000 » Xu Xun et al.等(1981)对产于中国皖南的蕲蛇毒液中的出血毒素进行纯化，分离出3种出血毒素。这些毒素分别命名为AaHI、AaHI和AaHI，并与台湾产的白吻蛇毒液中的出血性毒素进行比较。没有两种出血性毒素是完全相同的，它们之间的确切关系还需要进一步研究。 Bjarnason 和Tu (1978) 以及Nikai 等人。 (1984)从afmr蛇毒中分离出6种出血性毒素，分别命名为出血性毒素a、b、c、d、e、f。二阶提纯的出血毒素f，与前五种出血毒素一样，含有1个Zn2+。出血毒素f由572个氨基酸组成，分子量为64000。它既能水解胰岛素的B链，又能水解纤维蛋白原的T链，但不影响Aa链和Bp链，故不能使纤维蛋白原成为纤维蛋白凝块。出血毒素f因子在免疫特性上不同于其他出血毒素。具有致死活性，不仅可引起局部出血，还可引起广泛内出血。从Crofa/ws plus ews蛇毒中仅分离出一种出血性毒素，命名为ProteinaseH。这种毒素可能是

蛇毒中惟一的一种出血毒素，因为它的出血活性与粗毒的出血能力 相当。Proteinase H为单链糖蛋白，分子量为85 700,具有酪蛋白水解酶活性，但不能水解 精氨酸酯。EDTA可以抑制其出血和蛋白酶水解活性，被抑制后的出血毒素不能通过对 Ca2+或Znh透析使活性恢复，有趣的是用苯甲磺酰氟处理可使活性恢复。a2-球蛋白是许 多蛋白酶的抑制剂，用该球蛋白与Proteinase H —起温育不能抑制其蛋白水解酶活性。 Huang等(1984)对从棕点竹叶青蛇毒中纯化的出血毒素I (HR!)的性质 进行了研究，并纯化出了出血毒素I (HR2)。用SDS-PAGE法测定HR2为纯蛋白，分子量 为81 500,含糖10%，由669个氨基酸组成，单肽链;只艮分子量为23 500,由203个氨基 酸组成。HI^和HR2都能水解纤维蛋白原、酪蛋白和合成底物，HR,的水解活性比HR2 高得多。它们都不能水解TAME,也无PLA2活性。(3-巯基乙醇、抗血清能抑制它们的出血 活性。EDTA能彻底抑制HR:的出血活性、纤维蛋白原溶解活性和酪蛋白水解活性。ED- TA也能够彻底抑制HR2的酪蛋白水解活性和纤维蛋白原溶解活性，但只能部分抑制其 出血活性。加Zn2+(15mmol/L)可以使HR,出血作用恢复，但加Zn2+不能使HR2的出血 活性恢复，这两种出血毒素都含有Zn2+。HR,的出血活性可能与它的蛋白水解酶活性有 关，而HR2的出血活性可能与蛋白水解酶活性无关。Mandelbaum等（1984)从诺维特矛 头蝮蛇毒中分离出2种出血毒素，称为NHFa和NHFb。它们都是酸 性蛋白，等电点在4. 2〜4. 3范围内，都由一条肽链组成，分子量分别为46 000和58 000; NHFb的出血活性比NHFa大23倍，而NHFa的酪蛋白水解活性比NHFb高20倍;它们 都是金属蛋白酶，都能被EDTA和1,10-菲咯啉抑制;NHFa和NHFb在抗原性方面十分 相近，如果用抗B粗毒的马血清做试验，二种毒素的抗原性相同，但如用 抗粗毒的家兔血清做试验，二者的抗原性有一定的差别。

除上述蛇毒外，一些学者还对其他一些蛇毒中的出血毒素进行研究。Mebs等(1982) 从_喹anWans)蛇毒中分离出一种出血毒素，该毒素无酪蛋白水解活性，也无精氨 酸醋酶活性，但有致死活性，其半致死剂量为1.6mg/kg。Sanchez等（1987)从Z.

蛇毒中分离出一种出血因子，命名为LHF-I。该因子为糖蛋白，用SDS-PAGE测定分子量为100 000。它的出血活性与本身的酪蛋白水解活性有关。Sugihara等(1983)从 产于中国的烙铁头 蛇毒中分离出一种出血毒素，命名为Mucrotox-in A。该毒素分子量为94 000,等电点4. 3,含有3个Ca2+和2个Zn2+，不含糖。该毒素不 能水解酪蛋白，也不具有致死活性。Kishida等（1985)进一步研究发现，它虽不能水解酪蛋 白，但能水解二甲酰酪蛋白、胰岛素B链和纤维蛋白原。水解纤维蛋白原时先作用A(a) 链，然后再水解B(p)链，但产物不能形成纤维蛋白凝块，这说明该毒素水解A(«)链和B (P)链的部位与凝血酶不同。Mucrotoxin A能引起内脏广泛出血。Ovadia等(1987)从A- ⑶蛇毒中分离出一种出血毒素，该毒素分子量为50 000,为酸性蛋白。 纯化的出血毒素的出血活性是粗毒的12倍。该出血毒素在pH6〜9范围稳定，在PH5. 0 或pH9. 5时活性下降一半，在56℃条件下温育15min活性丧失。没有测出该毒素具有蛋 白水解酶活性，它不能水解酪蛋白、明胶和合成底物。出血活性可以被EDTA抑制，而且 不能通过加Ca2+或Zn2+恢复，也可以被蛇的血清中和。抗巴勒斯坦蝰蛇 蛇毒的血清也可以中和该出血因子的出血作用，用免疫扩散检查发现有一条沉淀线，说明 这两种蛇毒的出血因子有相似的抗原性。蛇毒与抗眼镜蛇毒血清 产生广泛的沉淀反应，对其他三类蛇毒血清也有弱的沉淀反应。Civello等（1984)从响尾 蛇 蛇毒中分离出一种出血毒素，命名为出血蛋白酶IV。这种出血毒素 经胰蛋白酶和从该毒中分离的另一种蛋白酶I处理，其活性不变，但处理后的出血蛋白酶 IV经SDS-PAGE测定发现有部分被水解。

眼镜蛇毒一'般不含出血毒素，也不含内狀酶，但眼镜王蛇 蛇毒 比较特殊。Weissenberg等（1987)用Sephadex G-75对该毒进行凝胶过滤，分出几个蛋白 峰,其中峰1具有蛋白酶活性，但只有部分的组分有出血活性。粗毒和峰1的蛋白质都能 水解酪蛋白和BAEE,还具有舒缓激肽释放酶的活性，但都不能水解胶原蛋白和明胶。该 蛇毒的出血毒素较特异，它的出血作用依不同动物而不同，以家兔和野兔为实验动物时， 该毒无出血作用，但能引起小鼠、大白鼠和家鸽出血。 

有(或很弱)蛋白酶活性。由于这种偶合，使人们在这个问题上徘徊了半个世纪，只有在对 许多出血毒素进行纯化后，才有了较正确的认识。现在看来出血毒素的出血作用与蛋白水 解酶活性并没有必然的联系。首先，蛇毒中有许多蛋白水解酶，但大部分的蛋白水解酶没 有出血活性;其次，自然界某些非蛇毒组分如细菌胶原酶等，虽然没有蛋白水解酶活性，但 也有出血作用。蛇毒的出血毒素有些有蛋白酶活性，如蛇毒中分离出5种出血毒素，其中出血毒素a的出血活性较大，但蛋白水解酶活性却最 小。Grotto(1967)从蛇毒中纯化出的1种出血毒素具有明胶水解酶的活性， 大豆胰蛋白酶抑制剂或DFP可以抑制它的明胶水解酶活性，但不影响它的出血作用，这 说明两种作用可以分开。Park(1961)认为出血作用和明胶水解作用由毒素的两个活性部 位分别承担，抑制剂抑制了活性中心的明胶水解活性部位，从而引起酶活性的丧失。 Ohsaka (1960)较先从蛇毒中分离出不具蛋白水解酶活性的出血毒素。他把从蛇毒中初步纯化的HR2通过Bio-Rex 70柱层析分成2种不具蛋白水解酶活 性的出血毒素HR2a和HR2b。Ovadia(1978)从 蛇毒中分离出的出血毒素 HR3几乎没有蛋白水解酶活性，只有弱的明胶水解酶活性。除此之外，0shima(1972)从蛇毒中分离的出血毒素HR-I以及最近Mebs(1982)从Bfrisanrtans 毒中分离的出血毒素也没有水解酶活性。能够引起出血的动物毒除蛇毒外还有蜘蛛毒、蝎 毒及壁虎毒，而它们有些没有蛋白水解酶活性。例如蜘蛛毒可以引起肠道出血，但并未发现该毒中含有蛋白水解酶，暗示它的出血作用与蛋白水解活性无关。还有部 分学者认为出血活性和蛋白水解活性密不可分，他们的主要证据有以下几个方面:首先， 在提纯的出血毒素中所谓没有蛋白水解活性的出血毒素极少;其次，几乎所有的出血毒素 蛋白水解酶活性被EDTA等抑制时它们的出血作用也都消失，这说明二者的关系十分密 切;再次，现有测定蛋白水解酶活性的方法不够灵敏，所用的酪蛋白-三氯醋酸沉淀方法只 能测定对酪蛋白的水解作用，而且是活性较大的出血毒素，而那些对酪蛋白无水解活性的 或特异性较小但对其他底物能水解的出血毒素却无法进行测定。这方面的例子不少，例如 从烙铁头蛇毒中纯化出的出血毒素不能水解酪蛋白，但它能水解甲 酰化的酪蛋白、胰岛素B链和纤维蛋白原，又如蛇毒中的HR3虽不能水解酪蛋白，但能水解明胶。即使最没有蛋白酶活性的HR2a和HR2b 也能作用于分离的毛细 血管基底膜并释放出肽和多糖。基底膜主要由胶原蛋白以及其他与多糖结合的蛋白质组 成，HR2a和HR2t可能被某些因子激活，直接对基底膜中的蛋白底物进行作用。

出血毒素另外一个显著的特点是含有金属离子，其出血活性和蛋白水解酶活性能被 EDTA等金属熬合剂抑制。过去对粗毒的研究表明，与蛋白酶活性以及出血活性有关的 金属离子有Ca2+、Mg2+和Zn2+。Ca2+和Mg2+很容易经透析部分除去，对大部分蛇毒来 说，失去部分Ca2+和Mg2+对出血活性影响不大，而对蛋白酶的活性有较大的影响。Zn2+ 很不容易透析出去，这说明它和蛋白质结合较牢固。以后的研究也表明绝大多数出血毒素 都含有Zn，而且结合得较牢固。对从尖吻竣蛇毒中分离的出血毒 素，Ac-Proteinase的Zn2+含量进行了分析，其结果与从蛇毒中分离的出血 毒素HT-e相似，每个出血毒素的分子都含有i个zn2+，如果Zn2+被除去，两种毒素的出 血活性和蛋白水解酶活性都消失。Nikai还比较了当时发现的所有具有蛋白水解酶活性的出血毒素，结果发现，不管何种蛇毒，也不管蛇分布在何种区域，其出血毒素中都含有 Zn2+。当Zn2+被除去后，拉曼光谱的低频部分发生较大的改变，这说明Zn2+对出血毒素的 作用关系极大。除去Zn2+还会引起出血毒素螺旋结构含量降低，自由松散结构含量增 加和松散结构增加。Zn2+的丢失可能和出血毒素失去生物活性有关。从蛇毒中分离出来的出血毒素a、b、C、d、e和f都含有1个Zn2+，用EDTA和1，10-菲咯啉处理后， 它们的出血活性都消失，用1,10-菲咯啉除去出血毒素e中的Zn2+，它的出血活性和蛋白 水解酶活性消失，如再加Zn2+，则活性又恢复。未除去Zn2+前，对出血毒素e的C. D谱进 行分析，发现二级结构中有23%的a-螺旋结构、6%的卩-折叠结构和H%的松散结构，当 90%的锌离子被除去后，螺旋结构的含量下降到7%，而松散结构则增加了。由于Zn2+ 的除去还引起紫外吸收光谱的变化，这些变化与芳香氨基酸有关，Bjamason等人还认为 Zn2+可能在分子中与Tyr的苯酸基结合。从蛇毒中分离出来的出血 毒素Ac-Proteinase除去Zn2+也有与出血毒素e相似的结构变化。有些出血毒素除分子 中含有Zn2+夕卜，还含有Ca2+，例如从蛇毒中分离出来的出血毒素 Mucrotoxin A 就含有 2 个 Zn2+和 3 个 Ca2+.  Zhang 等（1984)对从蛇毒中分离出来的出血毒素I所含离子进行了研究，发现每个毒素分子含有一个Zn2+和二 个Ca2+。它的活性可以被Ca2+加强，能被Zn2+轻度抑制。当用EDTA处理时，它的活性 彻底消失。如对1，10-菲咯啉透析，其中50%〜80%的金属离子被除，出血毒素I的活性 也降低50%〜80%。如果上述透析液中含5mmol Ca2+，那么毒素的活性有90%保留，这 说明Ca2+对出血毒素I的出血作用是十分重要的。C.D谱分析也说明Ca2+在稳定出血 毒素I结构方面起重要作用，至于Zn2+的作用现在还不清楚，更不知道加Zn2+为什么能 轻度抑制出血毒素I的活性。

出血毒素所含的金属离子多为Zn2+和Ca2+。有些学者认为Zn2+在维持出血毒素的 酶活性及生物活性方面起重要作用。也有的学者发现Ca2+对从 蛇毒中分离出来的Proteinase b有稳定作用，Zhang等的研究和Oshima的实验结果相 似。一般地说大部分出血毒素的活性依赖于Zn2+的存在，有些出血毒素则需要Ca2+。

Shutzman等（1980)报道EDTA不能除去金属蛋白中的Zn2+，Zhang等也发现在 5mmol/L浓度条件下EDTA也不能除去AaH I中的Zn2+，但如用0. lmol/L的EDTA究较多，其目的是从分子水平上弄清各种出血毒素的抗原性之间的关系，为研制广谱抗出 血毒素血清打下基础。人们对不同蛇毒组分抗原性关系的研究有很长的历史，已经积累了 丰富的资料，过去人们多用粗毒和粗毒抗血清为材料研究不同亚种、不同种、不同属以及 不同科蛇毒抗原性之间的关系。研究结果显示，亲缘关系越近，免疫交叉反应越强，抗原关 系越密切。随着对蛇毒各组分的不断分离，人们逐渐开始对蛇毒某种组分在不同蛇毒中的 抗原关系进行研究。最初多对不同来源的突触后神经毒素之间的抗原关系进行研究，以后 开始对不同来源的膜毒素、PLA2以及神经生长因子各自的抗原关系进行研究。神经毒 素、膜毒素和PLA2分子量都比较小，一级结构分析较容易。通过对一级结构比较，很容易 发现它们的同源性。而对于神经生长因子和出血毒素，由于分子量比较大,有些还含有碳 水化合物，所以对它们一级结构分析很困难，要想了解它们之间结构的关系，用抗原抗体 反应显得十分重要，在某些情况下可称为惟一的方法。幸运的是，这些年在这方面的研究 取得了很大的进展，下面作些介绍。

早先Mandelbaum(l976)从美洲矛头蝮蛇毒中分离出一种出血 毒素HF2，Assakura等（1986)又从该毒中分离纯化出两种出血毒素HFi和HF3,并同时 对3种出血毒素的免疫特性进行了研究。研究结果发现，尽管这3种出血毒素的理化特性 以及生理活性有差别，但它们在免疫特性上相似，这说明它们的抗原性相似。Mandel- baum 等（1988)比较了 3 种问属于矛头竣类和蛇毒中金属蛋白（包括出血毒素和蛋白酶)的免疫特性，发现不同 出血毒素之间抗原性相似，而不同非出血毒素蛋白酶之间抗原性相差很大。Mandelbaum 等（1989)还对响尾蛇毒和蝰蛇毒出血因子的免疫特性进行了比较。他们用抗HFi、抗 HF2、抗和抗 NHFa、抗 NHFb(来自的家兔血清测定其他粗毒中出血毒素的免疫特性。结果发现矛头蝮类蛇毒出血毒素和 响尾蛇各亚属蛇毒出血毒素抗原性相似，但类蛇毒之间的同源性更 大。巨蝮类蛇毒、北美类蛇毒、亚洲蝰蛇类和蝮蛇类 蛇毒的出血毒素和类出血毒素之间也有一定的相似性。蜂蛇中的 咝蝰属(所汾)和蝰属类蛇毒的出血毒素能部分地被抗血清中和。Martinez等 (1989)比较了蛇毒中几种出血毒素之间的抗原性以及其他响尾蛇毒出血毒素的抗原性。他们把r蛇毒中的两种出血毒素通过免疫方法制出单克隆抗体， 然后用ELISA方法测定蛇毒中几种出血毒素之间的免疫活性以及其他响尾蛇 粗毒中出血毒素之间的免疫活性。其他这些响尾蛇包括:C.

scutatus^Crotalus v- lutosus^Crotalus v. oreganussCrotalus horridus horridus^C. molossus .结果表明，不但aimr蛇毒中几种出血毒素之间抗原性十分相似，而且和其他响尾蛇出血毒素的抗原性也相似。总的来说，虽然出血毒素之 间确切的同源性还不知道，但它们肯定在结构上有某种相似性，这种相似的结构可能和 它们引起出血的活性位点有关。