蛇毒 变构蛇神经毒素及其他

1.变构蛇神经毒素结构研究

运动神经元病是一种严重威胁人类健康的疾病。本病发病缓慢，起初双手无力，随之逐渐出现肌肉萎缩，最后全身肌肉萎缩，病多在3-4年内致残或死亡。自1869年发现该病以来，人们对其进行了广泛的研究，并取得了一定的进展。现在认为该病是由运动神经元病变引起的。这种疾病的治疗没有取得太大进展。过去常用促肾上腺皮质激素和干扰素。虽然可以获得短期效果，但由于用量大、成本高，难以推广。变构蛇神经毒素是近年来应用广泛的一种制剂。它不仅克服了上述药物的缺点，而且使部分患者获得了满意的短期疗效。

变构蛇神经毒素是一种复合物，由两种或两种以上的蛇毒与神经毒素混合加工而成，加工方法主要是氧化修饰。改良后的蛇毒混合物毒性明显降低，大部分非神经毒性成分变性失活，神经毒素的毒性也大大降低，但仍可能具有与神经纤维相互作用的能力。这种效应可能是变构蛇神经的结果。毒素对运动神经元病有效的原因。

用于实验室研究或临床应用的变构蛇神经毒素种类繁多，制备方法和毒液成分也各不相同，但基本上可分为国外和国产两种。在国外，Sanders等人的修改方法。 (1978) 是主要方法。他们以泰国眼镜蛇毒和台湾银环蛇毒为原料，过氧化氢为氧化剂，辅以其他辅助试剂进行反应。也有人用过氧甲酸、臭氧、N-溴代琥珀酰亚胺作为氧化剂。桑德斯等人准备的准备工作。经过上述修饰的称为Modified Snake Neurotoxin (MSNT)。他们控制反应程度的方式是通过时间长度来衡量的，例如，肌肉注射的标准配方为3.5 天，静脉注射的MSNT 为14 天。在中国，毛庆武等人的方法。是主要方法。他们选择中国眼镜蛇毒代替泰国眼镜蛇毒，湖南或江西平房毒代替台湾平房毒。为了弥补中华眼镜蛇毒中I型神经毒素的不足，配方中加入了一定量的I型突触后神经毒素。在控制修改程度方面，毛清武等人。利用光谱分析测定蛇毒分子构象变化程度来确定反应时间，大大提高了控制反应的科学性。毛庆武制备的这种制剂被称为变构蛇神经毒素（ASNT）。

是否是桑德斯等人制备的改良蛇神经毒素（MSNT）。或毛庆武等人制备的变构蛇神经毒素（ASNT），主要成分是修饰的神经毒素（NT）。其他毒素和酶蛋白几乎全部被破坏，特别是心脏毒素、细胞毒素、胆碱酯酶、PLA2和蛇毒中的蛋白水解酶等都被破坏形成沉淀。对ASNT 进行G-100 凝胶过滤和CM-SephadexC-25 柱层析，可以分离出两种非常接近的蛋白质组分，其中一种是修饰后的神经毒素（NT），这与使用等电聚集凝胶和凝胶电泳的结果一致，14种组分可以通过修改前相同的CM-SephadexC-25层析分离。另外，与未修饰的相比，ASNT的N端氨基酸分析显示有6~7个不同的末端蛋白或多肽，这是修饰前后两个样品的又一较大差异。

目前，对ASNT的结构已经进行了一定程度的研究，目的是阐明其作用机制，以期更有效地治疗运动神经元病。 ASNT构象的研究主要局限于光谱分析。由于以往对NT在眼镜蛇毒和环蛇毒中的构象进行了大量研究，通过比较可以得到ASNT的结构变化。 ASNT水溶液中色氨酸和酪氨酸残基在280nm波长处的紫外吸收峰明显减弱或完全消失。 ASNT的紫外光谱变化与Tu报道的溴丁酰亚胺氧化蛇毒NT的紫外光谱特征基本一致。这种变化可能是由于NT中的色氨酸或羟吲哚被氧化，也可能是由于NT发色基团修饰进入分子内部，使吸收的光减弱或消失。荧光光谱法也得出了类似的结论。 ASNT中色氨酸残基的发射光谱完全消失，只有波长为320nm和390nm的微弱发射光谱。这表明几乎所有的色氨酸残基都被修饰，而少量的酪氨酸和苯丙氨酸保留下来。

毛清武等。还利用偏振红外吸收光谱测定了ASNT的构象，发现ASNT中的NT仍以氧化为主，只有少部分蛋氨酸和部分二硫键被氧化修饰。在«-金环蛇毒素分子中，Met27在分子表面，即-金环蛇毒素含有2个Mets，它们也在分子表面，它们很容易被氧化成亚砜。在1030cm-1区域出现亚砜伸缩振动吸收峰。目前的共识是ASNT中NT的二硫键没有太大变化，肽键也没有断裂。

综上所述，MSNT或ASNT与原毒相比，有以下差异： 在成分上，MSNT或ASNT的成分由于修饰而大大简化。 MSNT或ASNT的成分除少量其他成分残留外，主要是NT； NT也不同于原毒，是修饰的NT，毒性大大降低，修饰后的侧链主要有色氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸等，二硫键一般不解旋，肽键也不断裂.因此，NT的多位点侧链基团的氧化修饰是构象变化的主要原因，从而导致生物活性和毒性的变化。就ASNT的结构与活性的关系而言，目前还缺乏必要的实验证据来解释此类问题，主要是因为ASNT的组成不单一，功能复杂，而且还存在缺乏简便易行的ASNT功能测定方法。

2. 出血性毒素构象研究

由于出血性毒素的分子量较大，有的还含有非蛋白质成分（如多糖、脂类），因此对其一级结构的研究不多。在高级结构方面，多局限于水溶液中构象变化的研究，下面举例说明。

Bjarnason 和Tu 从西部小菜蛾响尾蛇毒液中纯化出五种出血组分，分别标记为a、b、c、d、e。毒素e的激光拉曼光谱中1655cm-1和1665cm-1的双峰表明毒素e的自然状态是混合的

有序和无序结构，去锌后毒素e的酰胺I谱带在1 655CHT1消失，相反，出现在 1 671cm-1处，揭示去锌毒素e的无序度增加。天然与去锌态的毒素e在230nm〜330mn 处的C. D谱中表现出显著的变化，推测锌存在于Tyr附近。当加锌重组后，重组毒素e的 C.D谱形近似天然状态，与此同时，活性也有部分恢复。同样，上述过程在275nm〜290nm 引起的紫外吸收变化证明锌和Tyr的酚基相连。

日本名古屋大学的研究小组以台湾尖吻蝮蛇蛇毒为原料，分离 出5种毒性组分，以ACl、AC2、AC3、Ac4、AC5命名。除Ac4仅有出血活性外，其余4种兼具 出血和致死活性，而且ACl活性还依赖Zn2+。ACl在与锌结合后的拉曼谱中，酰胺I谱带 呈现由1 665cm-1至lj 1 670cm-1的位移。在低频区观察到的奶此!!!-1谱带很可能是锌以 Tyr作为配位体的特征谱带。在许多金属酶中，His残基常作为配体，因此，Zn-N配位键 的可能性也不能排除。

徐洵等(1982)从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分离出3种出血毒素，分 别命名为AaHI、AaHI和AaHM。前2种为酸性蛋白，后1种为碱性蛋白。3种出血毒 素的分子量都为22 000,都具有致死毒性、蛋白水解酶活性和纤溶活性。对AaH I的荧光光谱研究表明:谱在304nm的小肩反映了 Trp残基的存在。pH、温度、一定浓度的SDS、EDTA均可引起 AaH I荧光强度和出血活性的同步变化，I -和丙烯酰胺的淬灭研究证明Trp残基比较 接近分子表面。对AaH I的远紫外C.D谱呈215nm〜217nm的单负峰，为典型的卩-折叠 结构的图谱。AaH I在中性和弱酸性环境中稳定，当pH增加或pH<4. 0时，出血活性、纤

溶活性降低或消失。C.D谱支持这一结果：当pH>10. 0或pH<4. 0时，肽链有序度丧 失。但当溶液的pH从碱性(pHlO.O)回到中性(pH7.0)后，构象仍能恢复。AaH I的活性 对于金属离子Ca2+的依赖性也得到C.D谱有力的支持。AaHM的近紫外C.D谱的 294nm、275nm 2个负峰分别属于Trp的吲哚基和Tyr的酚羟基。在远紫外C. D谱中，存 在204nm〜208nm的1个较宽负峰。计算表明，中性条件下，AaH I含有43%的(3-折叠结 构和16%的《-螺旋结构，其余为无规则卷曲。经EDTA处理后的C D谱结果显示金属离 子在稳定蛋白质构象中起重要作用。有关出血毒素的化学修饰至今只有徐洵等(1985)做 了一些工作，她以皖南产尖吻蝮蛇狀扣奶)蛇毒中分离的出血毒素I(AaH I ) 为材料进行化学修饰研究.

AaH I共有7个组氨酸，当用DEP修饰后,AaH I的C. D谱 和荧光光谱没有改变，这说明修饰作用不改变AaH I的高级结构。AaH I活性的丧失是 由于直接对组氨酸修饰引起的。一般认为不可能3个组氨酸残基对AaH I活性都为必 需，但至少有1个残基是AaH I表现活性必需的。在PH4. 5条件下，NBS可修饰AaH I 中的Trp、Tyr和His,经修饰后，AaH I的活性也丧失。Trp被修饰的程度和AaH I活性 丧失大小没有比例关系。另一方面，二恶烷MNB-bromide都可以作用于Trp残基，但对 AaH I活性没有影响，这说明AaH I的失活与Trp残基被修饰无关。AaH I含有9个 Tyr，用乙酰咪唑修饰其中的2. 5个〜3. 0个Tyr残基，其活性不受影响。用TNM对 AaH I进行硝基化也不影响其活性，因此认为Tyr也不是AaH I表现活性所必需的，这 也就是说由NBS修饰3种残基引起的失活可能是因为修饰3组氨基酸残基的结果。综上 所述，对AaH I进行一系列化学修饰工作结果表明，AaH I的活性中心含有组氨酸残 基，而Tyr和Trp对活性中心无直接贡献。

三、舒缓激肽增强肽的结构特点

蛇毒中舒缓激狀增强肽(BPP)是含5个〜13个氨基酸残基的活性多肽，对血管紧张 素I转化酶有很强的抑制作用。BPP既能抑制激肽I增加舒缓激狀的作用，又能抑制血 管紧张素I，是一种有效的降压物质。

从1965年Ferreira在美洲矛头蝮蛇wmraoz)蛇毒中发现舒缓激肽增强肽 以来，1983年王茂音统计已阐明结构的BPP共计有13种，如表3-15-3所示。从表中可以 看出，BPP在结构上有共同点：它们的氨基酸残基数在5〜13之间，N-末端为焦谷氨酸， C-末端为脯氨酸。由于N-末端是焦谷氨酸，无法进行Edman降解，BPP中脯氨酸的含量 又很高，这给过去BPP的结构分析带来了很大困难。有趣的是它们含有谷氨酰胺和天门 冬氨酰胺，但是除了 N-端以焦谷氨酸存在的谷氨酸外，相对的谷氨酸和天门冬氨酸却极 少或没有，肽链中过多的脯氨酸又造成蛋白酶专一裂解的困难。

天然BPP大致可分为两类，即分子较小，仅为5肽的美洲矛头蝮蛇BPPa和肽链在10 肽左右的其他BPP。10肽左右的BPP的C-末端大多是以Ile-Pro-Pro结尾，只有2个例 外:一个是日本蝮蛇亚种蛇毒BPPA，其C-末端少1个脯氨酸，增强舒缓激肽的活力很低， 若人工合成其衍生物，并在C-末端多加1个脯氨酸，活力就增高200倍左右;另一个是日 本蝮蛇亚种BPPE，其C-末端为Ser-Pro-Pro,活力也同样很低，与组分BPPA的活力相接

近。这说明C-末端Ile-Pro-Pro结构是这一类BPP活力所必需的。

为了研究BPP结构与功能的关系，目前人工合成的各种BPP衍生物已有100种左 右，大致上也是按上述两类BPP(即美洲矛头蝮蛇BPP5a& BPP9a)的结构加以改变而合成 的。表3-15-4例举了几种有关的BPP类似物。可以看到，当BPP5a类似物N-末端的焦谷 氨酸残基被谷氨酸所取代，或此焦谷氨酸残基被移去，增强舒缓激肽的活力就明显下降, 说明此N-末端的焦谷氨酸残基对生物活力是有重要作用的。与此相反，1«^^的类似物 N-末端移去2个残基后，有的活力反而升高1倍左右。但两类BPP在结构与功能关系上 也有共同之处，如碱性氨基酸残基被取代后，活力都明显下降。

表3-15-4两类BPP类似物结构与功能的关系

美洲矛头蝮蛇BPP5a类似物

生物活力#

美洲矛头蝮蛇BPP9a类似物

生物活力*

Glu . Lys . Trp . Ala . Pro

100

Glu . Trp . Pro . Arg . Pro . Gin . lie . Pro . Pro

410

Glu . Lys . Trp . Ala . Pro

6.3

Glu . Gly . Leu . Pro . Pro . Arg . Pro . Gin . lie . Pro . Pro

320

Lys . Trp . Ala . Pro

0. 5

Leu . Pro . Pro . Arg . Pro . Gin . lie . Pro . Pro

200

Trp . Ala . Pro

0. 2

Glu . Gly . Leu . Pro . Pro . Gly . Pro . Gin . lie . Pro . Pro

28

AC

1

Glu . Lys . Trp . Ala . Pro

15

Leu . Pro . Pro . Gly . Pro . Gin . lie . Pro . Pro

58

 

 

一般认为BPP肽链越长，它产生的生理活性就越明显，起生理作用时持续的时间也 越长。这可能因为长链肽在体内被蛋白酶水解的要慢些，不易马上排出体外。对于能够抑 制血管紧张素转变的活性肽而言，如果肽链较长且分子的中间含有一些碱性氨基酸，那么 它对血管紧张素转变的抑制作用要强些。也有不少例外的情况。王茂音等(1983)对浙江 产蝮蛇G4. Zm/於 Pallas)蛇毒中提取的BPP;的结构和功能进行了研究，且BPP,的结构 已被测定出来(见表3-15-3)，当用焦谷氨肽酶移去BPP: N-末端的焦谷氨酸残基时，对舒 缓激肽的增强效应反而升高1倍左右，此后随着逐步进行Edman降解，活力也随之下降， 但降解至C-末端三肽时，生物活力仍保留约90%，至C-末端二肽时，活力就骤然丧失。对 BPP1 C-末端用羧肽酶水解时，lh后活力降低二分之一。这些都说明，BPPi C-末端结构的 完整是其生物活力所必需的。Squibb实验室人工合成了多种BPP类似物，其中类似于二 肽的SQ14 225(2-甲基-3-巯基丙酰-脯氨酸)却具有比天然BPP更高的活力，这种物质已 应用于临床治疗肾型高血压。这也间接说明，BPP的生物活性并不一定需要很长的肽链。 由此可见，有关BPP肽链长度、氨基酸组成和生物活性之间的关系是复杂的，只有在更深 入研究的基础上才能进一步弄清楚。