蛇毒中膜毒素的生理作用

根据膜毒素产生的生理活性不同，可分为心脏毒素和细胞毒素等几类。有些膜毒素具有多种生理活性，因在某些方面具有较强的生理活性而归入某一类。

(—) 溶血

早在本世纪初，人们就知道眼镜蛇毒中的一种成分可以直接引起溶血。后来才知道蛇毒中的PLA2能溶解红细胞膜上的磷脂。因此，特纳认为引起溶血的成分是PLA2。但后来证明纯PLA2很少能直接引起溶血，所以蛇毒溶血就成了一个谜。直到从唾液蛇的毒液中分离出类似于蜂毒肽（Melittin）的裂解液（H. said ms）

血液中的强碱性蛋白，这样的问题才真正迎刃而解。后来，这种能直接引起溶血的碱性蛋白被称为直接溶血因子（direct hemolytic factor，DLF）。很快证明，亚洲各地从眼镜蛇毒液中分离出的心脏毒素具有溶血能力，但活性不同。溶血现象有两个特点： 第一，不同种类动物的红细胞敏感性不同；豚鼠的红细胞对台湾眼镜蛇毒的心脏毒素最敏感，而鸡的红细胞对心脏毒素（200Mg/ml）的溶血作用有抵抗力。这种差异与不同种类动物的红细胞膜上脂质的不同组成有关。其次，极少量PLA2 的存在可以显着增强DLF 的溶血作用。两者协同作用的实质是DLF可以引起膜脂结构紊乱，促进PLA2的接触，加速磷脂的水解。早期工作中所谓的DLF、心脏毒素和细胞毒素都是混有PLA2（1%~5%），所以它们的溶血时间-速度曲线都显示

现在加速度越来越大，各种膜毒素混合的PLA2量不一样，溶血活性很难定量，更不用说互相比较了。有证据表明，如果通过疏水层析或反复亲和层析将PLA2含量降低至0.05%，DLF的溶血时间-速度曲线将呈直线；当PLA2 的含量下降到0.001% 时，心脏毒素IV 在浓度低于700/xg/ml 时几乎不会溶血（Bougis 等人，

1983).虽然哈维等人。也承认上述膜毒素在没有PLA2的情况下没有或几乎没有溶血活性，他们认为：可能有两种膜毒素，一种可以直接溶血；另一种不能直接溶血，需要PLA2的参与。但是布吉斯等人。相信即使微弱的溶血活性也是由残留的PLA2 产生的，因此DLF 这个名称似乎陷入了危机。有关溶血的详细信息，请参见第19 章。

(2) 细胞毒性

细胞毒性可以通过在显微镜下观察细胞形态的变化来判断，也可以通过测定作用后胞外酶浓度的变化来判断。迪马里等。 (1975) 报道说，SV1 () 1 细胞损伤的程度与它们释放到细胞外空间的乳酸脱氢酶成正比。一般认为，细胞毒素与细胞膜上的受体结合会改变细胞膜的结构，从而导致细胞损伤。肝素通常中和细胞毒素，可能是因为它是一种酸性物质，可以与碱性毒素形成复合物，使它们无法与受体结合。 1967 年，Braganca 等人。等人从高氯酸处理的印度眼镜蛇毒液中提取出一种能优先破坏大鼠吉田肉瘤细胞的碱性蛋白成分，并将其命名为细胞毒素P6。该细胞毒素的分子量约为10500，具有相当高的热稳定性，其含量占粗毒的40%。该成分不仅能破坏人或小鼠红细胞、白细胞、淋巴细胞、小鼠脾脏和腹膜渗出液细胞等正常细胞，还能优先破坏吉田瘤、小鼠艾氏腹水瘤、KB、AH等实验性肿瘤细胞-13、HeLa 和L232 细胞。后来证明原来的Ps其实是不同细胞毒素的混合物。 P6是最著名的细胞毒素，它能抑制Na+-K+-ATP酶活性，抑制程度与细胞毒性成正比，因此认为细胞毒性的本质是破坏细胞内Na+和K+的平衡，破坏这种平衡，使细胞膨胀，细胞结构发生变化。黑颈眼镜蛇毒液体外分离毒素r

可对KB产生毒性，而CM-XI和Cytotoxin-XI对Yashida癌细胞和腹水肝癌细胞的毒性较高。科特等人。 (1972)报道，蛇齿蛇和响尾蛇毒液可对Hela细胞、人乳腺癌细胞和Hep-2等细胞产生细胞毒作用。 Tu和Giltner（1974）研究了6种响尾蛇毒、3种毒蛇毒、5种眼镜蛇毒、4种海蛇毒和部分蛇毒成分的细胞毒作用，发现响尾蛇毒和毒蛇毒具有对KB 和Yashida 癌细胞无影响。它有剧毒，可以使这些细胞破裂；眼镜蛇毒的毒性较小；海蛇毒液几乎没有细胞毒性。欣曼等人。 (1987) 研究了蛇毒的分离

发现分离的心脏毒素D对小鼠脾脏淋巴细胞的作用对T淋巴细胞更敏感，对巨噬细胞和B淋巴细胞产生相同溶解作用所需的毒素是上述作用浓度的1000倍。毒素D的还原和甲酰胺甲基化不影响其对T淋巴细胞的作用。如果用高浓度的毒素作用于T淋巴细胞，10分钟内就会有50%的T淋巴细胞溶解。脾细胞对毒素的敏感性增强了5倍以上。心脏毒素D可破坏质膜，4时仍有裂解细胞作用。

一般来说，对癌细胞有破坏作用的细胞毒素对正常腹腔内细胞也有不同程度的破坏作用，因此作为抗癌剂使用还存在一定的问题。

(3)心脏毒性

许多类型的膜毒素都会对动物心脏产生影响。 1947年，Sarkar首先通过盐析从印度眼镜蛇毒液中分离出一种能使离体猫心脏停止跳动的碱性蛋白，因此命名为cardiotoxin。后来，许多学者研究了这种毒素，发现这种毒素存在于20多种蛇毒中。心脏毒素主要存在于眼镜蛇的毒液中，但一些响尾蛇的毒液中也含有。 1985年分离出50多种心脏毒素及其类似物，并确定了其中许多的一级结构。根据结构特征，心脏毒素可分为两类：一类是从蛇毒中分离出的心脏毒素，属于膜毒素，无酶活性。

心脏毒素在体内有相似的作用，都能使心肌去极化，从而使心肌受损而衰竭。对心脏 毒素的作用方式可以通过几种方法进行测定:一是将毒素注射到动物体内，再测定实验动 物血液动力学的改变及心电图方面的变化，其中包括心率、心输出量、血压等。二是用毒素 作用于动物离体心脏，再测定心脏功能的变化。三是用细胞培养的方法使毒素与细胞直接 作用，从细胞水平上了解其作用机制。Wollberg等（1988)研究了从蛇毒中分离的心脏毒素的作用方式。这种毒素的LD50 = 15/ug/kg大白 鼠，静脉注射一个致死剂量的毒素，几秒种后心电图就会发生明显的改变，几分钟后心脏 衰竭。对离体小鼠和人心脏作用，会使心脏收缩加强。Sun等(1986)研究了从中国眼镜蛇 华南亚种毒中分离出来的心脏毒素对离体心脏的作用，心脏组织包括心脏 前房、心室和整个心脏。研究表明，心室经心脏毒素作用后，收缩的频率、收缩力和细胞内 电位都发生变化，而对其他心脏组织作用较小，对所有心脏组织的作用都是可逆的。对灌 注的小白鼠心脏大剂量注射心脏毒素可以使细胞电位产生很大的变化，但洗出毒素 lOmin后恢复。Ca2+和肝素都能降低心脏毒素的作用。从台湾眼镜蛇毒中分离出4种心脏 毒素，命名为I、II、III和IV。II、M和IV能引起心肌的收缩和去极化，而I却不能。它们的 作用可以被高浓度Ca2+阻止，而对神经-肌肉传导和肌肉收缩有生理作用的试剂不能阻 止它们的作用。这说明心脏毒素不是作用在兴奋-收缩偶联的某个环节，而是直接作用于 细胞膜上。可能是作用于膜使之产生小孔，使肌细胞去极化及Ca2+内流。

(四）细胞通透作用

膜毒素对细胞通透性的影响与它们的细胞毒作用不同，前者作用的结果是使细胞内 外物质的分布发生改变，但被作用的细胞没有死亡，更没有破裂;而细胞毒作用的结果是 使细胞死亡，大部分最终破裂，它们的初级阶段也使细胞的透性增加，最后严重到使细胞 肿胀和破裂的程度。

能够影响细胞通透性的膜毒素很多，具有细胞毒性的膜毒素和能引起可兴奋细胞去 极化的膜毒素都能改变细胞的通透性。这里主要介绍响尾蛇胺对细胞通透性的影响。响 尾蛇胺是从响尾蛇恐怖亚种蛇毒中分离出的碱性多肽，共有2种，分别称为响尾蛇胺A(Cobramine A)和响尾蛇胺B(Cobramine B)。它们的氨基酸数比 膜毒素少，一级结构与神经毒素、膜毒素以及PLA2都没有相似性。Larson等(1968)发现 它们能阻遏甲状腺切片对碘的积累。实际上这些毒素同样影响被考察的各种动物组织如甲状腺、腮腺、脉络丛、小肠及肾对阴离子如碘、氨基酸、3-0-甲基葡萄糖以及对氨基马尿 酸等的传送。这种现象有可能是因细胞膜上专一离子输送泵受到干扰，也可能是因非专一 性的膜结构遭破坏直接导致物质外渗。Jacobi等(1972)证明印度眼镜蛇细胞毒素使豚鼠 红细胞溶血时膜上钠-钾-ATP酶活力没有明显变化,钠离子从红细胞中外流速度也保持 正常。因此，至少就红细胞而言，毒素在它的主动传递栗损伤之前就干扰了它的通透性，造 成细胞内离子外漏。

(五）兴奋细胞的去极化作用

心脏毒素或直接溶血因子除能引起心肌和平滑肌收缩外，在高浓度(（lmg/ml)时还可 以造成龙虾或乌贼巨神经轴突传导阻滞;在浓度为时能造成骨骼肌 (如小鸡颈二腹肌、蛙肌)和豚鼠膈肌进行性挛缩，这是细胞膜不可逆去极化的结果。实际 上毒素浓度只要lfxg/ml〜5/ug/ml就足以使肌细胞外膜电位显著下降，在肌肉应激性完 全消失前，突触传导并未受影响。即使用中等浓度（lOOug/ml)毒素处理鼠膈肌也并不能 影响标记的a-银环蛇毒素(a-Bungarotoxin)对它的专一,性结合以及运动终板上乙酰胆碱 酯酶的活力。这说明心脏毒素与神经毒素不同，它们确实不能封闭运动终板上的乙酰胆碱 受体，而只是引起去极化。事实上这种去极化作用并不局限于终板区，而是沿着整个肌纤 维或神经轴突发生的。此外，预先由高钾介质引起的去极化蛙肌仍能被心脏毒素诱发挛 缩，这说明膜的钠钾泵似乎并非为这种挛缩产生的必要前提。另一方面，从被毒素处理过 肌肉中取得的肌球蛋白和肌动蛋白在ATP存在时仍能相互作用而产生沉淀。这些事实 说明这类心脏毒素引起的去极化和肌肉挛缩作用只是通过膜发生的效应，因而与毒素的 其他效应相似。当肌纤维被Toxin 7处理时会释放钙，而提高钙在介质中的浓度又会抑制 由毒素诱发的心室纤颤。

(六）对细胞膜酶活性影响

膜毒素作用于细胞膜可以引起酶活性的改变。它们可以加强3-磷酸甘油醛脱氢酶、 腺苷酸激酶、3-鱗酸甘油激酶和醛缩酶的活性。这种激活作用可能是由于毒素使膜的结构 改变，使这些酶原来未被利用的催化位点暴露，从而加强其活性。这类毒素可以使Mg2+ 依赖性的由Na+、K+激活的ATP酶失活，因为这种酶只有在膜结构完整时才能起作用。

(七）抗菌作用

早就知道直接溶血因子(DLF)浓度达50Mg/ml时能抑制葡萄球菌的繁殖。杜雨苍等 (1985)观察到中华眼镜蛇毒中5个膜毒素抑制大肠杆菌生长的能力与它们溶吉田肉瘤的 活性间存在着平行的关系，估计细胞毒素的抗菌作用也还是通过影响细胞膜的通透性实 现的。

由于生物化学的进展比药理学的研究进展要快，所以许多膜毒素及其类似物的理化 性质和结构已被测定出，但还不知道它们的作用，因此有些细胞毒素可能也具有心脏毒等 的功能，而有些原来被认为是细胞毒素的分子，经严格测定可能又不具有细胞毒的作用， 这种情况也见于其他类型的膜毒素。