蛇毒抗凝组分的鉴定

蛇毒的抗凝成分尚未得到很好的研究。眼镜蛇科蛇毒中的一些抗凝血成分主要是由于其具有抗凝血酶作用，如眼镜王蛇和黑颈眼镜蛇的蛇毒能显着干扰凝血酶的产生。某些蝰亚科和蝰亚科的蛇毒也具有类似的抗凝血活性，即具有抑制凝血活酶的作用，而尖吻蝰蛇属Akiba spp.的蛇毒则具有抑制凝血酶的作用。和浙江白花蛇有此成分。

Agkistrodon 毒液的抗凝成分对兔子血液凝固的体内作用导致全血凝固时间显着但短暂的延长和初级凝血酶原时间的延长。但第二阶段凝血酶原和血浆纤维蛋白原水平无明显变化，推测凝血时间延长是由于凝血酶原酶的产生影响。

蛇毒中抗凝成分的鉴定同样可采用体外试管法，测定凝血时间（正常值为102min）或血浆复钙时间（正常值为1.5min3min）。如果蛇毒中含有抗凝成分，凝血时间和血浆再钙化时间都会明显延长。

蛇毒的促凝或抗凝作用可能是某些蛇毒中一种成分的作用，但大多数蛇毒是几种成分的综合作用。例如，大多数蝰蛇科蛇毒、大多数响尾蛇蛇毒和一些眼镜蛇蛇毒可同时含有促凝血和抗凝血成分。因此，蛇毒对血液凝固的总体影响显得复杂。蛇毒成分的作用可表现为单一或联合的促凝作用，或单一或联合的抗凝作用。有时也表现为促凝成分和抗凝成分的共同作用。因此，除了极少数只具有促凝作用的眼镜蛇毒和一些毒液较多的只具有抗凝作用的蛇毒外，相当数量的蛇毒无法归类为促凝或抗凝，并且存在还有一些蛇毒对血液系统既不促凝也不抗凝。

一些蛇毒对凝血系统的影响错综复杂，由于各个研究者的实验方法不同，有时会出现相互矛盾的报道也就不足为奇了。

纤溶成分可激活纤溶酶原，也可增加链激酶对纤溶酶原的活化。这种纤维蛋白溶解成分可以在蝰蛇科的毒液中找到。

Agkistrodon agkistros 和Agkistrodon spp 毒液中的纤维蛋白溶解成分。和浙江白蛇毒不同，它们的作用是直接溶解纤维蛋白，与纤溶酶的作用相同。 Agkistrodon acarina的纤维蛋白溶解成分同时具有血液毒活性。用EDTA等可完全抑制其纤溶活性，也可抑制其出血活性，说明该成分是一种“金属蛋白成分”，也说明其纤溶活性与出血活性密切相关。浙江产的蕲蛇毒纤溶成分略有不同，无明显出血活性，无溶血作用。

蛇毒中纤溶成分的鉴定可用纤维蛋白平板法测定。取一定量的待测样品置于凝固的纤维蛋白板上，37保温18小时，测量圆形溶解孔的大小。溶孔面积的大小与纤溶活性成正比。

纤溶活性成分作用于纤维蛋白后会生成纤维蛋白降解产物(fibrin degradation product，FDP)，因此在动物实验中也可以通过测定FDP来衡量纤溶活性。通常临床试验可通过副凝血试验、免疫学检查或致敏红细胞凝集抑制反应来测定。如果有纤溶成分，FDP会明显升高。

(1)纤溶成分的测定

测定方法（Astrup 等人，1952 年）:

将用咪唑盐缓冲液（pH7.4，0.05mol/L咪唑缓冲液和0.85%氯化钠体积比为1:9）配制的10ml纤维蛋白原溶液（0.2%）水平放置于每个培养皿中.然后用微量移液器吸取0.2ml凝血酶（每1ml含100IU）加入板中使其凝固。轻微震荡5s后，凝固板成型。每块板准确加入检测液0.025ml，然后在WC中孵育20h，测定溶出区。酶活性以两个垂直方向的直径毫米表示。每次试验，每个样品平行进行3次，然后取平均值。

(2)纤维蛋白原溶解成分的测定

方法一(Ware et al. 1947)

将纤维蛋白原溶液（20 mg/ml）和一定浓度的待测溶液（用pH 7.4的咪唑缓冲溶液配制）分别在37预热3 min。取一定体积的待测溶液加入等量的纤维蛋白原溶液中，记录反应时间，不同时间分别取一定体积（0.2ml或0.5ml），置于50ml试管中，试管中加入30ml咪唑缓冲液， 搅拌均匀。向试管中加入0.1ml温热的凝血酶溶液（100IU/1ml），混匀，室温放置30min，1500r/mm离心20min。如果有纤维蛋白凝块，用玻璃棒小心取出纤维蛋白凝块，用滤纸吸干并用生理盐水清洗。将洗净的凝块放入装有1.0ml 10%NaOH的试管中，煮沸30min，加入5ml水、3ml 20%Na2CO3和1.0ml冲泡试剂，混匀。保持20分钟后，用分光光度计测定540nm处的吸光度，根据酪氨酸标准曲线测定可凝固的纤维蛋白原。

方法二（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）

本方法主要用于定性测定待测样品对纤维蛋白原的水解程度和纤维蛋白原链水解的难易程度。

将纤维蛋白原(20mg/ml)和样品(0.1mg/ml)溶解于0.03mol/L pH7.4醋酸铵缓冲液中并保温，不同时间间隔取100W反应液进行如下处理：先将1004溶于含4%SDS、10%对巯基乙醇和0.5mol/LEDTA的溶液中，37孵育2h。处理过的样品进行SDS-PAGE。电泳胶为5%，其他条件同SDS-PAGE测分子量。不加酶溶液的纤维蛋白原对照显示3条带，为链状，其他经酶作用的电泳图可与对照对比，判断酶对纤维蛋白原是否有作用，哪条链对其最敏感。

(3)抑制血块收缩的测定

蛇毒中的一些血小板功能抑制剂能抑制血块收缩，测定方法如下：

兔血

(四）复钙时间测定

0. lml家兔柠檬酸盐血浆与0. lml样品在37'C水浴中温育5min后，加0. lml 2. 5X 10_2mol/L CaCl2溶液，并记录血浆复钙时间。对照是将样品液改为含0. 15mol/L NaCl的 Tris-HCl 缓冲液(pH7.3)。

(五）凝血酶时间测定(夏盛强等，1987)

配1%人纤维蛋白原于PH7. 4, 0. lmol/L Tris-HCl缓冲液中。取0. 5m丨于小试管 中，加0. 25ml待测酶液，于37€保温4h。若不凝固，则加入0. 01 %凝血酶溶液0. 2ml，观 察凝血酶的时间延长。溶液不凝固，则推测为具有纤维蛋白原溶解活性。