蛇毒 肌肉毒性的检测方法

肌毒素的作用可因来源不同、剂量不同、注射途径不同、实验动物不同而不同。轻度病例仅引起局部水肿；严重者可引起局部组织坏死；严重者可引起全身肌肉受累及肌红蛋白尿症状。局部组织损伤也是蛇咬伤临床上最棘手的问题。很多被蛇咬伤的病人经过治疗虽免于一死，但由于组织损伤导致肢体残疾，甚至不得不截肢。以往对蛇毒引起肌肉坏死的研究很少，主要是缺乏理想的实验方法。近年来，国外对蛇毒肌坏死的研究取得了一些进展，特别是分离纯化了几种具有特异性作用的肌毒素，发现了一些可以定量检测组织坏死程度的方法和指标，为很抢眼。

早期对组织坏死的研究主要是通过光学或电子显微镜进行观察和描述，但在观察前，先处死实验动物并制作观察用样品。这种方法不仅工作量大，而且不能应用于临床。尽管如此，该方法仍然是目前常用的经典方法，因为它具有准确可靠的优点，适用于各种来源和性质的肌毒素。测定时，一般将蛇毒或成分注射到小鼠后腿肌肉中，一段时间后处死动物进行显微镜检查或电镜拍摄。本方法可用于定性测定，也可通过计算坏死肌细胞与正常肌细胞的比值进行定量测定。例如，深见用黄绿色铁头蛇的毒液给兔子注射，将中毒的肌肉做成组织切片，用显微镜检查，然后计算出肿胀和坏死的程度。另一种是利用组织或肌肉坏死引起的血清中某些酶活性的变化来测定，该方法可用于临床。肌酸激酶（CK）或磷酸肌酸激酶（CPK）是存在于细胞质中的重要酶类，长期以来被用于肌营养不良、心肌梗死等组织损伤性疾病的临床诊断。 CK或CPK的高低是否可以用来判断蛇毒肌毒素的作用强度，很多学者进行了研究。

坂本等。 (1968) 报道，注射黄绿罗铁头(T.FawowWcfo) 蛇毒后动物血清CK 水平升高，而肌肉CK 水平降低。中田等。 (1980) 报道血清CK 水平与蛇咬伤后经过的时间和解毒量呈正相关。中田等。 (1984)比较了几种蛇毒引起的坏死程度，以探讨蛇毒引起的血清CK值升高是否可以作为肌肉坏死的定量指标，同时也考察了抗蛇毒血清对肌肉损伤的影响。发现血清CK值升高与注射毒物的量和坏死程度（显微镜下观察）成正比。

举起。在比较的9种蛇毒中，眼镜蛇毒比响尾蛇毒具有更高的CK值和更强的肌肉坏死。若加用抗蛇毒血清预处理，CK仅在初期升高，随后明显下降。这表明抗蛇毒血清具有中和作用，但不会立即中和局部伤口上的所有毒液。古铁雷斯等人。用6种蛇毒给大鼠肌内注射，研究肌坏死的作用，发现它们的作用方式相似。

可引起细胞结构的变化。一些毒液会产生与血浆CK 浓度升高相关的形态学变化。 Gutierrez 从蛇毒中分离出的碱性PLA2 的溶解活性也与CK 浓度有关。

它还反对使用CK 水平来确定肌毒素的强度。莫里森等人。 (1983)发现小鼠注射某种蛇毒后，CK值高低不规律。 Ownby 等人。 (1982) 使用CK 水平来确定草原响尾蛇(C.wWcfewWcfe) 蛇毒肌毒素a 引起的肌肉坏死程度。他们发现注射毒素后CK 水平出现两个峰值。第一个峰值与毒素刺激的肌肉收缩有关。它与肌肉损伤无关；第二峰与肌肉病理变化呈正相关。因此，他们认为使用CK水平来判断肌坏死程度应谨慎。

从以上实验结果可以看出，虽然用血清CK水平来衡量肌坏死程度有一定的局限性，但它适用于大多数肌毒素，将对理论研究和临床治疗大有裨益。如果能在早期定量测定毒蛇咬伤的肌肉损伤程度，并及时采取预防措施，就有可能大大降低致残率和截肢率。

海耶斯等。 (1986) 研究了从草原响尾蛇（Crote/w 蛇毒）中分离出的溶肌毒素Myotoxin I 对培养的新生大鼠肌管细胞的影响。正常情况下，只有少部分肌管细胞不规则收缩。但加入18.5nmol/L毒素后，大部分溶肌毒素会收缩，这给毒素的检测带来了方便。如果能用类似的方法检测其他溶肌毒素的活性，将是检测溶肌毒素的最佳方法。方法的革命。

过去，研究蛇毒的肌肉毒性主要是用粗毒液，因为没有分离出特异性作用于肌肉的毒性成分。另一方面会检测某种蛇毒是否具有肌肉毒性，只能使用粗毒。字符串等。 (1971) 报道了泰国眼镜蛇毒和草原响尾蛇毒对小鼠骨骼肌超微结构的影响。他们用电子显微镜观察了整个肌纤维及其成分的退化，肌丝融合成块，肌管消失。线粒体膨胀成含有一些细胞碎片的液泡。退化的肌纤维变成含有少量细胞碎片的低电子密度物质，周围环绕着一些质膜痕迹。非洲毒蛇Viper Gaboon也会损伤肌肉，它能使肌肉的琥珀酸脱氢酶完全失活，肌纤维内部出现空泡，肌肉条纹消失。古铁雷斯等人。等(1983)用6种CoraLSna虹蛇毒液肌肉注射研究其对大鼠的肌坏死作用，发现其作用相似，均能引起肌坏死，细胞内结构均发生改变。一些蛇毒引起肌肉坏死，也增加了动物血清中CK 的水平。甜瓜等。 (C1988) 发现Agkistrodon 毒液可以从分离的小鼠或青蛙肌肉组织的肌浆中释放和LDH。在不含Ca2+ 的培养基中也有影响，这表明毒物的影响与PLA2 活性无关。但从某些动物如双子宫袋鼠、负鼠血清中提取的酸性糖蛋白和肝素可抑制肌溶解，肌溶解可引起CK水平升高。抑制可能是由于血清的酸性成分或肝素与碱性肌溶素的复合物。 Ownby 等人。 (1988) 用光学显微镜研究了三种不同的蛇毒对大鼠肌肉组织的影响，并分阶段描述了它们的作用方式。这3种蛇毒都是草原

响尾蛇 、西部菱斑响尾蛇和眼镜蛇。注射蛇毒后0. 25h到 4周每隔一定时间检测一次。不同蛇毒由于含有的肌坏死成分不同，结果也不一样。例如 含有肌溶毒素的蛇毒产生的肌坏死作用与纯肌溶毒素产生的作用相似;含有出血毒素蛇 毒产生的肌坏死作用与纯出血毒素产生的作用相似。但是它们的作用都可以分成四个阶 段:第一阶段为注射毒后15min〜180min，被影响的肌细胞所处的状态不同，与粗毒中所 含的肌坏死组分有关;第二阶段为注毒后6h〜24h，这时受损的肌细胞进一步加剧，但各 种蛇毒有各自的特点；第三阶段为注毒后48h〜96h，这时所有受损的细胞都达到相同的 病理状态——坏死，这个阶段，各种蛇毒的作用相同；第四阶段为注毒后1周〜4周，这个 时期，坏死的组织部分或全部恢复。