蛇毒蛋白的分离技术SDS

（-）原则

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的流动性受其静电荷和分子大小的影响。如果两种蛋白质分子大小的差异被电荷差异所补偿，则两种不同分子量的蛋白质可以以相同的速度向阳极移动。因此，不能用一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定分子量。为了解决这个问题，夏皮罗等人。已尝试在十二烷基磺酸钠（SDS 阴离子洗涤剂）存在下获得分子量。 Weber 和Osborn 基于他们最初分离蛋白质混合物的努力结果，使用相同的方法确定了大约40 种蛋白质的迁移率，并凭经验观察到这些蛋白质的迁移率与其分子量的对数成正比线性关系。

已证明十二烷基磺酸钠能与蛋白质的疏水区结合，将大部分蛋白质分离成它们的组成亚基（subunits）。 SDS 的组合也使变性和随机卷曲的多肽链获得大量负电荷，基本上掩盖了在没有SDS 的情况下通常会存在的任何电荷。虽然这项技术如此成功的确切原因尚不清楚，但它已被广泛用于确定纯化蛋白质的分子量及其亚基组成。

（二）操作方法

有几种常用于SDS 凝胶电泳的缓冲系统，包括连续系统和不连续系统。 Shapiro 和Weber 等人首先采用的标准SDS-磷酸盐连续系统。是比较简单的一种，具有一定的分辨能力，可以满足很多实验的要求，近年来得到广泛应用。

储存液和凝胶的制备储存液和凝胶液的制备方法见表3-13-12。

SDS-凝胶电泳可采用立柱式或立柱式，这里以立柱式为例进行说明。

将凝胶玻璃管插入电泳槽上槽底部的圆孔内，使其垂直。在玻璃管底部放一个小玻璃塞，盖上前在小玻璃塞表面均匀涂上一层薄薄的50%甘油。

从冰箱中取出的储备液均温至室温后，按表3-13-12中10%凝胶的比例混匀，将混匀后的溶液置于真空干燥器中抽气10分钟，加入10%过硫酸铵溶液，混匀后立即用细滴管将胶液加入凝胶玻璃管中。凝胶的高度为7cm。尽量使每管中凝胶的高度相同（提前画出刻度）。用注射器沿管壁在3mm4mm的高度轻轻加入蒸馏水至胶面。静置几分钟后，水凝胶界面消失，20min30min界面重新出现，再静置30min即可加入样品。

做胶水时一定要注意，在胶水表面加入蒸馏水时，水不要成滴状，而是要顺着管壁慢慢往下流，否则顶部的凝胶浓度会被大大稀释，这会影响样品的流动性并降低测量结果的准确性。

2、样品的制备一般是将蛋白溶解在含1%SDS和1%巯基乙醇的0.01mol/LpH7.2膦酸盐缓冲液中，100加热2min~5min。蛋白终浓度为0.5mg/ml1mg/ml。

表3-13-12 储存液和凝胶液的制备

原液

20ml凝胶溶液混合比例

5% 凝胶

10% 凝胶

我

凝胶储备液

Acr30gBis0.8g 加蒸馏水至100ml

3.33毫升

6.67毫升

我

凝胶缓冲液

SDS0.2g

加0.2mol/L，pH7.2磷酸盐缓冲液至100ml

10毫升

10毫升

我

1%TEMED

TEMEDlml

加蒸馏水至100ml

2毫升

2毫升

 

蒸馏水

 

4. 57ml

1. 23ml

 

 

 

以上溶液混合后抽气l0min

IV

10%过硫酸铵

过硫酸铵 lg 加蒸傭水至l0ml

0. 1ml

0. 1ml

表中Acr:丙烯酰按;Bis:甲撑双丙烯酰胺;TEMED:N,N,Nf ,N'-四甲基G二胺 注：贮液置冰箱保存;SDS在低温下析出，使用前微温使其溶解；贮液IV每2周新配一次也可以将上述溶液在37"C保温2h而不是100€加热。一般说来，两种处理的效果都 一样。但如果蛋白质样品中混有少量蛋白水解酶，37X：处理就会引起样品水解，使测定失 败，而10CTC加热3min —般都能使蛋白酶失活，得到满意的结果。也有少数例外的情况， 需要采用特殊的样品处理方法。

标准蛋白质样品的制备:称取细胞色素C、胰凝乳蛋白酶原A、胃蛋白酶、卵清蛋 白、牛血清清蛋白各0. 2mg左右，分别放入小试管中，按0. 5mg/ml溶液的比例，向样品 中加入“样品溶解液”(见试剂的配制），使充分溶解，轻轻盖上木塞(不要塞紧，以免加热时 迸出），将小试管放入沸水浴中加热3min,取出冷至室温。

待测蛋白质样品的制备:固体样品的制备与标准蛋白质相同。如待测样品已在溶 液中，可先配制“浓样品溶解液”(各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高一倍），将待测液与 “浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。若待测溶液太稀可事先浓缩;若溶液含盐量 太多则必须先行透析。

处理好的样品溶液即可用于电泳。对于直径为6mm的凝胶柱，每管加lOfxg蛋白质 (或更少一些)便可得到清晰的区带。根据样品溶液的浓度，加样体积可以1(^1〜15(^1。

处理好的样品溶液可在冰箱中保存较长时间，使用前在10CTC水浴中加热lmin，以除 去可能出现的亚稳态聚合物。

电泳轻轻取下凝胶管底部的小玻塞，注意保持玻管垂直装置在电泳槽上。将电泳 槽的上槽倾斜过来，使凝胶管口斜向下方，用滴管轻轻吸去流到凝胶管口的水。将电极缓 冲液注入下槽，将上槽轻轻放下，稍微转动，以除去凝胶管底部可能有的小气泡，也可用带 弯头的滴管轻轻吸去。

将电极缓冲液注入上槽，没过管口。

用微量注射器按号向凝胶管中加样，每管加一种样品，各加20/xK含蛋白质10叫），稀 溶液最多可加150/J。

加样完毕，打开直流稳压电源(负极接上槽，正极接下槽，事先都接好），将电流调至每 管8mA。保持电流强度不变，待染料(染料已事先加在“样品溶解液”中)迁移至距下口约 lcm处，停止电泳，需时4. 5h〜5h。

染色、脱色用带有细长针头的注射器吸满蒸馏水，插入凝胶与管壁之间，一面轻 轻旋转玻璃管，一面推针前进，并注入蒸馏水，使凝胶剥离玻管并滑出。在染料区带的中心 插入细铜丝作为标志，按编号加入试管，加入染料液，染色4h或过夜。次日，倾出染色液， 用蒸馏水洗凝胶数次后加入脱色液，数小时换一次脱色液，直至背景清.