蛇毒中突触前神经毒素

突触前神经毒素抑制乙酰胆碱的释放，从而阻断神经到肌肉的传递。这些神经毒素毒性极大，比突触后神经毒素具有更高的致死活性。突触前神经毒素在结构上与PLA2 相关。目前尚不清楚其神经毒性作用是否与其PLA2 活性有关，但有间接证据表明两者相关。一些突触前神经毒素还具有肌毒素的作用，表现为肌纤维坏死，由于在这方面作用更大，所以归类为神经毒素。

突触前神经毒素主要存在于眼镜蛇蛇毒中，海蛇毒几乎不含突触前神经毒素，均只含有突触后神经毒素，少数蝰蛇科和响尾蛇的蛇毒含有突触前神经毒素。例如，陈元聪等。 (1981) 从浙江骏蛇Pallas 的毒液中分离出一种具有PLA2 活性的突触前神经毒素。虽然突触前神经毒素的分布不如突触后神经毒素广泛，但不同来源的突触前神经毒素在分子特征和作用方式方面存在一定差异，因而更为复杂。下面介绍几种有代表性的突触前神经毒素。

（一）Notexin及其类似物

澳大利亚虎蛇毒液含有拟箭毒毒素和突触前神经毒素。从其粗毒液中分离出三种相似的蛋白质，即Notexin、NotechisI-5和NotechisI-1。其中，Notexin和NotechisI-5具有突触前神经毒素的特征。当以蛋黄为试验底物时，两种毒素的PLA2活性均较弱，但在乳化剂脱氧胆酸钠存在下，该酶的活性大大增强，与银环蛇毒素相似。来自其他来源（例如猪胰腺PLA2 和蛇毒PLA2）的PLA2 的活性也可以通过脱氧胆酸盐来增强。哈里斯等人。 (1981) 关于Notexin

对该毒素的酶学特性进行了研究，结果表明该毒素的水解底物依赖于Ca2+，其活性可被Mg2+、Ba2+、Sr2+、Zn2+和Mn2+抑制，其中Mg2+的抑制作用最弱作用，而Ba2+ 的抑制作用最强。酶的活性似乎对pH 和温度的变化无动于衷。 Notexin和NotechisK-5的半致死剂量（i.v）分别为1^g/kg小鼠和45/ug/kg小鼠，两种分子均为单链分子，含有119个氨基酸残基，7对二硫键键，分子量约13500。其结构与从猪胰腺分离的PLA2和从其他眼镜蛇毒液分离的PLA2有很大的同源性。如果按更大的相似性排列，则有43 个氨基酸相同。 Notechis1-1既无毒性也无PLA2活性，作用尚不明确，其N端部分序列与PLA2有很大的同源性。

(2) 太破新

澳大利亚大班蛇的毒液毒性极大，LD5()=2.1ug/kg大鼠。这个数字甚至低于纯Notexin。可以从这种蛇毒中分离出一种叫做Taipoxin 的神经毒素。它是一种突触前神经毒素，是粗毒液中致死活性的主要载体。含量占粗毒液干重的10%。 %。该毒还含有突触后神经毒素，但含量不到5%。

Taipoxin的LD50为2.1/xg/kg小鼠，由4个亚基非共价结合而成。组成太破新的亚基有3个，分别称为cx、B和r亚基。 a亚基是强碱性亚基。它是一个单独具有毒性的亚基，其性质与Notexin相似。即，该亚基在中性pH条件下难以溶解。异构体可以相互替代而不影响活性，7个亚基酸性很强，这是由4个唾液酸糖基引起的。这

PLA2 在激活酶方面发挥作用。 Taipoxin 非常稳定，8mol/L 尿素处理无影响，但在pH 6.0 时用taiol/L 盐酸胍处理可使亚基解离。在很低的pH值下也可以引起解聚，例如当pH值低于1.9时，亚基可以完全解离。 A。 B和M亚基的等电点不同，分别为2.5、7.0和大于10.0。静电相互作用可能在亚基的聚合中起重要作用。在中性条件下，亚基的解离是可逆的，在pH 1.9以下其解离是不可逆的，因为低pH使7个亚基的糖链部分受到影响。

(3) 响尾蛇毒素

响尾蛇毒素是从南美响尾蛇恐怖亚种的毒液中分离出来的

一种突触前神经毒素，早在1938年就得到了这种毒素的晶体。通过离心和电泳确定结晶形式的毒素是纯净的，但通过等电聚焦发现响尾蛇毒素似乎不是单一成分，且各组分的配比根据不同的分离条件而不同。这种差异可以解释为什么不同的致死剂量被测试和

其他一些差异。

响尾蛇毒素由两个亚基组成，一个亚基具有PLA2活性，称为响尾蛇毒素B；另一个亚基是酸性亚基，称为响尾蛇毒素A。 CrotoxinB具有PLA2活性和致死活性，但较弱，若与另一个亚基CrotoxinA结合，毒性将完全恢复。 CrotoxinB 的毒性也可以通过除CrotoxinA 之外的其他分子来增强。例如，从蘑菇中分离出的心脏毒素VolvatoxinA2 的分子量为25,000，等电点为4.5。毒性极小，可与CrotoxinB结合，加强后者Breithaupt (1975)分离出的其他两种P物种的毒性

经计算，Crotoxin B和Crotoxin A二者在Crotoxin中的摩尔比在0. 9〜1. 02之间， 标准的Crotoxin应是1 : 1，由于至少有两种类型的Crotoxin B，所以Crotoxin至少是由 两种同工酶混合而成，这两种毒素在纯化过程中一起沉淀下来，伴随着沉淀的还有一些其 他蛋白，它们对毒性没有什么贡献。静电作用可能是亚基聚合成Crotoxin的主要力，与 Taipoxin相似，离子交换层析可以使Crotoxin解离，而凝胶过滤却没有什么影响。cro- toxin的稳定性与pH关系甚大，在高pH或低pH条件下，如果两种亚基具有相同性质的 静电荷，则复合物容易解离。现在多用凝胶过滤与电泳相结合的方法来分离Crotoxin和 Taipoxin .

Crotoxin A不但可以增强Crotoxin B的毒性，而且可以抑制其PLA2活性，抑制的程 度达90%，但Fraenkel-Conrat(l976)却得出相反的结果，他们报道Crotoxin A与Cro- toxin B有相似的活力。人们普遍认为Crotoxin A的作用是抑制Crotoxin的非特异结合， 加强Crotoxin结合到高亲和力的结合部位。具有PLA2活性的Crotoxin B亚基的活性能 被对-溴苯甲酰甲溴(BPB)抑制，但如果B亚基和A亚基结合，B亚基就不被修饰剂修饰。 这说明酶的活性中心在形成复合物过程中被保护。但如果用共价键把A和B两亚基联结 起来，虽然再无神经毒素，但PLA2的活性仍存在。用分子状态的短链 卵憐脂为底物，发现Crotoxin和Crotoxin B水解底物的特性相似。这种底物能对Crotox- in产生一定的解离作用，使之分离成A和B两个亚基，使Crotoxin B具有水解底物的作 用，但仍不能解释Crotoxin和Crotoxin A在活性大小上相当。Crotoxin可以与底物的类 似物D-二庚酰基卵磷脂结合，但不能对它进行水解，结合后的离解常数为0. 12mmol/L， 这个数值与Crotoxin B与D-二庚酰基卵磷脂形成的复合物的离解常数相当（约 0.13mol/L)，这进一步说明结合后的Crotoxin对底物仍然是敏感的，也就是说Crotoin

A对Crotoxin B的抑制作用可能不涉及Crotoxin B的活性中心。现在惟一不好解释的现 象是二者结合后对BPB的作用不敏感。Canziazi等(1982)认为修饰剂结合的位置是酶结 合底物的活性位点，Crotoxin B与修饰剂的结合和它与底物的结合相似，二种亚基结合 后，这种结合作用的要求发生了改变，修饰剂不再与活性中心结合，但并不意味着活性中 心被覆盖，因此说Crotoxin仍然具有PLA2活性。分子状态的底物确实能引起Crotoxin 解离，这是它的酶活性的一个原因，但Crotoxin确实也能对分子状态的底物表现出PLA2 活性，但对聚合状态的底物没有水解作用。这就是说A和B结合后虽抑制了它对聚合状 态底物的PLA2活性，但并没有抑制其对分子状态底物的水解活性。Canziazi等(1983)进 一步研究Crotoxin A的抑制机制，发现A亚基的抑制作用表现在底物在聚集状态时，B 亚基不能与卵磷脂-水界面结合。Crotoxin B与Crotoxin水解分子状态二己酰卵磷脂的速 度相似，但该底物如以聚合状态存在，Crotoxin的水解活性比Crotoxin B要低得多。Cn> toxin B能水解二肉豆蔻烯酰卵磷脂微核，水解的速度与底物的物理状态有关，说明Cro¬toxin B 紧密地结合于底物的表面， Crotoxin 对这种微粒状态底物的水解活性只及 B 亚基 的十分之一，而且水解的速度与底物的物理状态有关，直接结合试验证明B能与脂-水界 面作用，而Crotoxin却不能。这些实验结果表明Crotoxin B除了有与底物作用的自由 PLA2活性部位外，肯定还有一个参与脂-水界面结合作用的酶活性表面，这一区域在A 亚基与之作用时失去了活性，但B中与PLA2活性有关的活性水解部位仍然存在。

Crotoxin A有3条多肽链,3条肽链通过7对二硫键联结成为一个整体，它的氨基酸 顺序与PLA2相应位置上的肽段相似，这说明A亚基可能是从一个缺失了 1〜22、62〜70 和105〜111几段肽的PLA2演化而来。这3条狀链分别含有40、34和14个氨基酸残基。

上面已经说过Crotoxin是由多种同工酶组成的混合物。Faure等（1987)发现，即使一 条恐怖响尾蛇分泌的蛇毒也有5种〜10种同功能毒素，它们的含 量相差很大。由多条响尾蛇分泌的蛇毒，其Crotoxin的数量不比一条蛇分泌的蛇毒多多 少，大概有15种左右，它们有的属于不同亚种蛇毒混合造成的。

在发现Crotoxin后的40年时间里，人们一直认为Crotoxin只有Croto/ws 蛇毒才有，但通过免疫化学研究发现许多响尾蛇科的蛇毒含有与Crotoxin相 似的毒素。现在知道从澳大利亚虎蛇蛇毒中分离出来的Mojavetoxin和 从蛇毒中分离出来的co«co/or toxin在结构和功能上都和Crotoxin相似， 这在过去是没有认识到的。Kaiser等(1978)从蛇毒中分离出了一种与 Crotoxin相似的一种毒素，称为toxin。这种毒素可以通过离子交换层析而分离 出几种相似的组分，它还能自动解离成酸性、碱性两种亚基，所有这些特点都与Crotoxin 相似。用ELISA法测定发现，抗Crotoxin的家兔血清能够与从蛇毒中分离出来的毒素以及它的碱性亚基产生很强的作用。用免疫扩散法测定，它们形成的沉淀线几 乎与Crotoxin形成的沉淀线相同，这说明同源性很强。