蛇毒蛋白组分的鉴定

从生物进化的角度来看，毒蛇的毒素是为了适应更有效的捕食活动而发展起来的有毒物质，使被咬物出现中毒症状，有利于毒蛇的捕食。被咬物产生的一系列中毒现象，属于毒理学研究的范畴。

最早明确蛇毒的有毒成分是酶类，如：磷脂酶82能引起强烈的溶血作用，因此研究者大多关注与酶活性相关的有毒成分。近年来，由于生化分离技术的飞速发展，人们了解到蛇毒中除了某些能产生中毒症状的酶类外，蛇毒中还含有剧毒的多肽毒素，而这些毒素不具有酶的催化活性。在蛇咬伤致死的各种因素中，这类毒素的毒性远远超过酶引起的中毒症状。因此，蛇毒中的毒素成分成为当前生物化学家、医学家、毒理学家和众多研究者的研究对象。迄今为止，已经阐明了多种蛇毒中此类毒素的化学结构和性质，以及它们的毒理特性。

与蛇毒中的酶一样，剧毒多肽类毒素在化学上是一类分子量较小的蛋白质。因此，要鉴别它们，只能通过其特殊的生物活性，即毒性试验来确定。生物活性鉴定方法有动物整体法、离体器官法和试管试验法等。实验室常用的动物有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、猫、狗等。离体器官也可用于检测生物活性，如青蛙或兔子的心脏，豚鼠的回肠或子宫等。在某些实验装置中，它们也可用于测试生物活性。试管法常用于血液和某些分离组织的细胞悬液。由于动物在生物活性鉴定中存在个体差异，往往需要注意实验中动物数量充足，严格控制实验条件和环境，然后对实验结果进行正确的统计分析。实验结果。

1. 氧化还原酶

(1) L-氨基酸氧化酶

有多种方法可用于测量L-氨基酸氧化酶的酶活性。主要有Wellner 和Lichtenberg 法（1971）、Nai 法（1976）、经典压力法、比色法和Holme 和Goldberg 法。下面介绍前两种常用的方法。

方法1（Wellner 和Lichtenberg 方法，1971 年）

原理： 苯丙氨酸可被L-氨基酸氧化酶脱氨生成苯丙酮酸，其烯醇形式可与硼酸盐反应生成络合物，在300nm处有强吸收峰。为了防止生成的苯丙酮酸被氧化，在反应体系中加入过氧化氢酶分解反应中生成的HzO2。

试剂：0.4mol/L Tris-HCl缓冲液，37时测定，缓冲液pH值为7.5，25时测定，缓冲液pH值为7.8； 1200IU/ml过氧化氢酶溶液； 0.04 mol/L-苯丙氨酸； 25% 三氯乙酸(TCA)；硼酸-砷酸盐溶液，最后加入1mol/L砷酸钠和1mol/L硼酸，用浓HCl调节pH至6.5，如有沉淀可过滤一次。

操作过程： 在18mmX150mm试管中加入80/umol/LTris-HCl缓冲液、60IU过氧化氢酶、2IU~30IUL-氨基酸氧化酶，总体积0.7ml。加入0.1ml0.04m0l/LL-苯丙氨酸后立即置于37水浴中，在每分钟振荡200次的条件下反应15min，加入0.2ml25%三氯乙酸终止反应.将反应液转移至离心管中离心，取0.5ml上清液与2.5ml硼酸-砷酸盐溶液混合，室温（2226）放置30min以上。以不含酶的溶液为对照，在300nm处测定吸光度，反应液一般在数小时内稳定。

酶活单位：的规定规定，在上述条件下，使0.D.300nm吸收值增加0.03的酶活为一个酶活单位。这个单位相当于早前以L-亮氨酸为底物，用压力计测量30分钟内吸收1W氧气所需的酶活性。

方法二（倪氏法，昆明动物研究所4室，1976）

L-氨基酸氧化酶活性用测定游离氨的纳氏试剂测定。反应体系组成如下： 8 mg/ml蛇毒溶液混入pH7.6、0.1mol/LTris-HCl缓冲液0.2ml、0.1mol/LL-亮氨酸（用上述缓冲液配制） 1ml，总反应体积1.2ml。 37孵育2小时，加1ml 27%三氯乙酸终止反应，静置20min过滤，取滤液1ml，加蒸馏水1ml，纳氏试剂加样液3ml，测定在430nm 处通过比色法测定氨的形成。

(2) 乳酸脱氢酶

乳酸脱氢酶的测定方法很多。根据酶的反应可分为两大类：一类以乳酸钠为底物进行正向反应；另一种是以丙酮酸为底物的逆反应。目前多采用以乳酸钠为底物的方法，因为该方法所需的氧化型辅酶I比较稳定，价格便宜，而以丙酮酸为底物的方法所需的还原型辅酶I很不稳定。此外，乳酸钠底物溶液也比丙酮酸盐底物溶液稳定，常温下可保存1个月。根据测定方法不同，可分为分光光度法和比色法。由于分光光度法需要紫外分光光度计，目前多采用比色法。

近年来，一些染料，如碘四唑蓝（INT）和氯化硝基四唑蓝（NBT），是利用正向反应形式的还原型辅酶I还原某些染料而建立的。反应，吩嗪硫酸二甲酯（PMS）作为还原型辅酶I 和染料之间的氢转运蛋白。该方法快速、易操作、重复性好。

方法一（乳酸脱氢酶比色法）

原理： 乳酸脱氢酶在载氢辅酶I存在下使乳酸脱氢生成丙酮酸。丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸苯腙。苯腙在碱性溶液中呈红棕色，显色的深浅与丙酮酸的浓度成正比。乳酸脱氢酶的活性单位可通过与同处理的丙酮酸标准溶液比色比较得到。

试剂：

0.1ml甘氨酸溶液：称取甘氨酸

酸7. 505g，氯化钠5. 85g,蒸馏水溶解后稀释到 1 000ml。

pH10. 0乳酸钠缓冲底物液：吸取70%乳酸钠溶液10ml，0. lmol/L甘氨酸溶液 125ml,0. lmol/L氢氧化钠75ml，混和，加氯仿数滴防腐，置冰箱保存。

辅酶I溶液:称取辅酶I (NAD+)10mg，加蒸馏水2ml，溶解后置冰箱保存，约可 用6周。

2,4-二硝基苯肼溶液:称取2,4-二硝基苯肼19. 8mg,用10m0l/L HC1 10ml溶解 后，加蒸馏水至100ml，置棕色瓶内，冰箱保存。

0. 4mol/L氢氧化钠溶液。

丙酮酸标准液（lnmol/L):准确称取纯丙酮酸钠11. Omg,置于100ml容量瓶中， 加入乳酸钠缓冲底物使其溶解并稀释至刻度。此液应新鲜配制。

操作:按表3-14-1进行操作。

表3-14-1乳酸脱氢酶比色测定法操作步骤

加入物(ml)

测定管

对照管

稀释蛇毒液

0. 1

0. 1

乳酸钠缓冲底物液

1. 0

1.0

 

辅酶I溶液 蒸馏水

0. 2

0. 2

混匀，置37'c水浴保温15min

2,4-二硝基苯肼

1.0

1.0

混匀，置37'C水浴保温15min

0. 4mol/L氢氧化钠

10. 0

10.0

 

 

混匀，室温放5mm，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光 度读数,以测定管吸光度减去对照管吸光度，于标准曲线上查其活力单位值。

标准曲线绘制:见表3-14-2。

表3-14-2乳酸脱氢酶比色测定法标准曲线绘制操作步骤

管号

加入物(ml)

0

1

2

3

4

5

6

丙酮酸标准液

—

0. 05

0.1

0. 2

0. 3

0.4

0. 5

缓冲底物液(lnmol/L)

1.0

0. 95

0. 9

0.8

0.7

0. 6

0. 5

蒸馏水

0. 3

0. 3

0. 3

0. 3

0. 3

0. 3

0. 3

2,4-二硝基苯肼

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1. 0

1. 0

 

 

置37’C水浴保温15min

0. 4mol/L氢氧化钠

10.0

10. 0

10. 0

10.0 10.0 10.0 10.0

 

0

250

500

1 000 1 500 2 000 2 500

 

 

混匀，室温放5min，用440nm或蓝色滤光板进行比色，以蒸馏水调零，读取各管吸光 度读数。将各管吸光度读数减去0号管读数后，与其相应的酶活力单位值在坐标纸上作 图，绘成曲线。

单位定义:以100ml标本在37°C与底物作用15min，生成1/xmol丙酮酸为1个乳酸 脱氢酶活力单位。

2.方法二(乳酸脱氢酶的定位染色）

按Rosalki法(1974)将完成电泳的凝胶浸入酶底物显色液(0. 036mmol/L磷酸盐缓 冲液、pH7.4 0.04g/L N-甲基酚嗪硫酸盐、0.74g/L硝基四氮唑蓝、0.50g/L NAD+、

0.356mol/L乳酸钠），37€避光保温30mm〜60min，含酶的部位呈紫蓝色区带。置7% HAc中保存。