蛇毒蛋白分离技术 稳定作用

蛋白质纯化中最困难、最耗时且经常容易失败的方面之一是将蛋白质稳定在活性状态。纯化过程中的每一步都需要保持蛋白质稳定。必须考虑的6个因素： pH； 氧化程度； 重金属浓度； 介质的极性；现分别描述如下：

(—)酸碱度

使用适当的缓冲液调节溶液的pH 值很容易，但在调节溶液的pH 值时可能会涉及一些微妙之处。例如，对于：酶，通常认为产生较高反应速率的pH值也是酶处于最稳定状态的pH值。不幸的是，情况可能并非如此，有相当多的例子表明酶测定的最佳pH 值和在储存期间保持酶处于稳定状态所需的最佳pH 值可能相差一个或几个pH 单位，因此，这是非常分别确定酶测定和酶稳定的最佳pH 值所必需的。缓冲液不仅必须具有适当的pH 值，而且还必须不对蛋白质产生不利影响。磷酸盐和焦磷酸盐缓冲液远非理想，因为它们充当一大类酶的竞争性抑制剂，这些酶使用无机或有机磷酸盐化合物作为底物或反应产物。必须注意所用缓冲液的浓度。一般来说，如果需要良好的pH 调节，具有大液泡的组织（例如植物和真菌）需要更大的缓冲容量。在某些情况下，甚至需要逐滴添加碱（例如氢氧化钠）以中和粗制组织匀浆。此时必须非常小心，不要在中和过程中引起待分离蛋白质的变化。

(2)氧化度

通常大多数蛋白质（H）都含有相当数量的游离巯基，可能有4个或4个以上的巯基参与与底物的结合，因此这几个巯基的反应活性非常活跃。巯基被氧化形成分子内或分子间二硫键，通常导致酶活性丧失。能阻止二硫键形成的化合物很多：2-巯基乙醇（P=L12g/ml）、半胱氨酸、还原型谷胱甘肽和巯基乙醇等，这些化合物加入蛋白溶液时，浓度应在510 mol/L5 * 10-3 mol/L范围。在溶液中，酶与硫醇分子之间发生如下交换反应：

酶-S—S—酶+RSH 酶—SH+酶—S—S—R

（不活跃）（活跃）（不活跃）

酶-S-S-R+RSH 酶-SH+R—S—S—R

（不活跃）（活跃）

因为这些反应的平衡常数接近1，所以需要大量过量的保护剂。这种情况表明，巯基试剂确实起到了保护剂的作用，使上述反应向右移动了很远。二硫苏糖醇及其异构体二硫赤藓糖醇符合这些标准。

二硫苏糖醇在分子中形成二硫键，形成空间结构允许的六元环。因此，当使用二硫苏糖醇作为保护剂时，少量的硫醇就可以提供较大的保护力，使蛋白质抗氧化。

在某些植物组织的研究中经常遇到的一种氧化剂是酶化合物。细胞分解时产生的酶化合物是造成新切苹果呈棕色的原因。通常用于对抗这些强氧化剂的保护剂是聚乙烯吡咯烷酮，然而，即使使用这种保护剂，蛋白质氧化仍然是一个严重的问题。

(3)重金属污染

除了氧化之外，巯基还可以与铅、铁和铜等重金属离子相互作用。这些重金属离子的主要来源是用于制备缓冲液的试剂、用于分离蛋白质的离子交换树脂和用于制备溶液的水。使用全玻璃蒸馏水或经特殊制备的混床去离子树脂得到的水可避免重金属污染。不推荐使用金属容器中的蒸馏水。有时即使是全玻璃双蒸水也可能仍有微量重金属存在，因此，在缓冲液中加入浓度为1XlCT4mol/L3Xl0T4mol/L的EDTA，就可以螯合全部或大部分有害金属离子（如果有对酶活性无抑制作用）。

(4)介质的极性和离子强度

纯化与膜或其他亚细胞成分结合的蛋白质有助于考虑溶剂极性。虽然这个问题最初是在纯化膜蛋白时遇到的，但现在很清楚溶剂的极性普遍适用于任何蛋白质，有些蛋白质需要更疏水的环境，可以用蔗糖、甘油和更具侵略性的试剂处理，如二甲基亚砜或二甲基甲酰胺等。通过降低溶液的极性，可以成功地将这些蛋白质保留在溶液中。合适的浓度往往必须通过探索性实验来确定，但常用的浓度通常为1%~10%（V/V）。使用这些试剂可以纯化许多曾被认为即使经过仔细研究也不稳定的蛋白质。然而，也有一些蛋白质需要具有高离子强度的极性介质才能保持其全部活性。对于这些罕见的情况，可以使用KCl、NaCl、NH4Cl 或(NH4)2SO4 来增加溶液的离子强度。在这种情况下，通常排除使用离子交换层析作为纯化手段。

(5) 蛋白酶或核酸酶污染

纯化蛋白质和核酸时经常出现的一个问题是材料中存在相应的蛋白酶和核酸酶。在体内，除非在仔细调节的条件下，否则不允许这些降解酶与其底物接触，但会在细胞破裂时释放。如果不注意稳定被分离的蛋白质，酶活性的持续丧失可以被认为是纯化蛋白质蛋白酶降解的标志。每当遇到这种不稳定情况时，都应考虑到这一点。有几种特异性蛋白酶抑制剂，如苯甲基磺酰氟（PMSF），可以部分降低蛋白酶活性，但有不良副作用，必须谨慎使用这些抑制剂，例如PMSf和二异丙基氟磷酸盐（DIFP）不抑制不仅是蛋白酶，还有其他各种酶。

(6) 温度

一般认为该蛋白在0X：最稳定，但现已明确证明从禽肝中分离出的丙酮酸羧化酶对寒冷敏感，仅在25X：稳定。一个与温度相关的问题是找到一个能更好地保存蛋白质的温度条件，在这种情况下

温度条件下，可以将蛋白质最安全地保存起来而不变坏。某些蛋白质可能以浓溶液形在0"c时保存较好，而另一些蛋白质可能需要温度低至一 2(TC或 一70°C才能保存其活性。以为条件越冷，蛋白质的稳定性越大的假定是不正确的，因为某 些蛋白质溶液经受冰冻和融溶处理是十分有害的。如果观察到这种现象，则在冰冻之前在 制剂中加入甘油或少量的二甲基亚砜可能会有所帮助。每种蛋白质的储存条件，必须通过 探索试验来确定，并且在纯化过程的每一步都需要考虑到这一点。