蛇毒 细胞毒素的鉴定

最早观察到，响尾蛇和蝰蛇类蛇咬伤患者的受伤肢体常发生组织裂解，严重时只剩下骨头。这种组织溶解被认为主要是由于蛇毒中含有的细胞毒素。

一些细胞毒素已被分离和纯化。例如，已从眼镜蛇毒液中分离出两种细胞毒素。它们在体外和体内对吉田肉瘤细胞和腹水癌细胞具有强烈的细胞毒作用。细胞毒素还直接裂解豚鼠、狗和猫的红细胞，因此它们也可能与直接溶血因子属于同一类。细胞毒素还可以使骨骼肌收缩，使处于收缩期的离体蛙心脏停止，因此也被认为是心脏毒素。同一种物质。

细胞毒素可引起多种细胞变性和溶解，其作用可能是由于其作用于膜受体，导致膜结构改变和细胞内容物释放。可以通过测量某些细胞内酶的量来了解细胞毒素的毒性作用。肝素能降低细胞毒素对细胞的毒性作用，因为肝素是一种聚合酸性粘多糖，而细胞毒素是一种碱性多肽，可将两者结合，降低细胞毒素对细胞膜受体的作用。

从眼镜蛇毒液中纯化得到的细胞毒素P6可以抑制Na+-K+-ATP酶的活性，并且这种作用与其裂解作用呈线性关系。细胞毒素抑制Na+-K+-ATP酶，可使细胞内K+、Na+含量失衡，导致细胞肿胀、破裂。

鉴定细胞毒素最简单的测试是试管法。可用腹水癌细胞或吉田肉瘤细胞。细胞毒素对这两类细胞的毒性很大，很容易观察到细胞裂解的现象。

细胞毒素的裂解可被钙离子完全抑制，因此在进行裂解试验时，必须排除钙离子的影响。用过的腹水癌细胞或吉田肉瘤细胞用生理盐水清洗56次，除尽红细胞外，用双层纱布滤出结缔组织，再用新鲜缺钙泰德清洗3次溶液，最后用Tyode溶液稀释成约5%（2X107个细胞/ml）的乳白色悬液，于5保存，当天使用。所有反应溶液都应使用15-缺陷Terroy 溶液制备。待试液在37保温一定时间后，将样品与一份丽丝胺绿和一份肝素溶液（2mg/ml）在陶瓷板上混合以终止反应。在血细胞计数器上观察计数，用染色细胞占细胞总数的比例表示受损细胞的百分比。

(―) 细胞毒性试验

方法1（Dye Exclusion Method of Mclimans et al. 1975）

用0.7%胰蛋白酶（Hanks溶液）从培养瓶中取出细胞，用Hanks溶液洗涤23次，然后将细胞液调至3X10个细胞/ml，取4.5ml细胞悬液加入0.5ml细胞毒素，浓度细胞毒素浓度为15f g/ml90/xg/ml。每30分钟取一定量的反应液，与0.4%莫斯蓝（Hanks溶液）和9:1混合，10分钟后，用血细胞计数法计算染色和未染色细胞的比例，并与不含细胞毒素的样品进行比较.在显微镜下染色的细胞是死细胞。

方法二

该方法用于测定细胞毒素对红细胞的毒性。该方法也可用于测定直接溶血因子(DLF) 的活性。

采集以柠檬酸钠为抗凝剂（3.8%）的兔血，离心去除血浆，用Hanks溶液洗涤23次，在试管中加入0.6ml 3%红细胞悬液，加入细胞毒素，细胞毒素终浓度为15； xg/ml90pg/ml，最后用Hanks定容至5ml，反应液37孵育2h，在540nm处测定吸光值。以不含细胞毒素的样品为对照，所有发生溶血的红细胞OD54Dnm为1.0。

(2)毒素对单层培养细胞干扰作用的测定

在培养细胞之前，在培养瓶中放置几张盖玻片，当盖玻片被细胞覆盖时将其取出。将上述细胞载玻片各1张分别放入每个含有3ml Hanks和toxin（15/xg/ml90/xg/ml）的培养瓶中，37孵育，用显微镜观察载玻片上的单层细胞。不同时期的显微镜破坏，以及显微照片。可以基于

细胞受到干扰的程度可以用来判断毒素的毒性作用。