一、基本原则
当悬浮液静止时，悬浮颗粒在重力场的作用下逐渐沉降。颗粒越重，下沉越快。反之，密度小于液体的颗粒向上浮。粒子在引力场中运动的速度与粒子的密度、大小和形状有关，而粒子的密度、大小和形状又与引力场的强弱和液体的粘度有关。红细胞大小和直径几微米的颗粒可以利用重力观察它们的沉降速度。蛋白质分子不可能仅靠重力观察其沉降速度，因为蛋白质分子颗粒越小，沉降越慢，扩散现象越严重，所以需要高速离心产生强大的离心力场.离心力场（G）可以由离心机转子的角速度（u，以弧度/秒表示）和粒子距旋转轴的辐射距离（r，以厘米表示）确定，根据以下等式确定：G=0)V
因为转子转一圈等于2；r弧度，所以转子的角速度用每分钟转数（revolutions/
mm)可以表示为因此，离心力场也可以表示为：
离心力场G=(2jtX转数/s)2r。例如，超速离心机的转速为60000转/分钟（即1000转/秒），离心池中心到转轴中心的距离为6cm，如下式所示，则此表明这种情况下产生的离心力比重力大24万倍，利用如此大的离心力，可以研究胶体粒径范围内各种颗粒和分子的沉降行为。报送特殊颗粒离心条件时，必须注明转子的转速、半径大小、转子已运转的时间。但通常记录的是旋转时离心管内液柱的平均半径（即离心管液柱中部到旋转轴线的距离）计算的离心力，单位为g的倍数。在实际工作中，为方便起见，无需计算。从Dohe和Cotyias制作的转子转速和半径对应的标尺列线图，我们可以计算出另一个值，通常我们都知道每分钟的转速（r/min）和旋转半径，然后是相对离心力力(g) 可以在此诺模图中找到。如图3-13-13所示，若已知离心机的每分钟转速和旋转半径，则可求出相对离心力。例如，每分钟的速度为3000，旋转半径为6cm，则相对离心力约为600g。
在离心机分析中，经常会遇到沉降系数的概念。沉降系数是指颗粒在单位离心力作用下沉降的速度，用单位表示，简化为5，量的单位为S。1 S等于1X1(T13s。最近常用沉降系数用来描述生物聚合物或亚细胞器的大小，蛋白质的沉降系数一般在1S~200S单位之间。
沉降速度是指物质在强大的离心力作用下单位时间内移动的距离。
超速离心分为两种，一种是制备型超速离心，一种是分析型超速离心。
2. 制备超速离心
(―) 差速分级离心
差速分速离心法又称差速离心法，是最常用的离心方法。这种方法是基于这样一个事实，即不同大小和密度的颗粒在它们的沉降速度上是不同的。通过施加离心力增加（逐步）的离心场，可以将分离的物质分离成许多组分。选择每个步骤的离心场力，使得特定类型的材料在预定的离心时间内沉降以获得“沉淀物”。在每个步骤结束时，沉淀物与“上清液”分离，沉淀物经过多次“洗涤”。 ”，最后得到“纯”的部分。在这种离心中，离心后，一般通过倾倒将上清液和沉淀物分离，分离后的上清液再高速离心分离第二部分沉淀， 使高速往复逐级分离出所需物质。这种差速分级离心法可能是从匀浆组织中分离细胞器最常用的方法。这种方法对于分离差异显着的细胞器最为成功大小和密度的数量级。在蛋白质的提取和纯化中，常采用差速分级离心法去除匀浆中不需要的成分，取上清液后再用其他方法纯化。因此，该方法首先用于蛋白质溶液的纯化方法，然后通过层析和电泳纯化。差分分级离心法如图3-13-13所示。
为提高分离能力，发展了另一种重要的离心方法，即区带离心。区带离心分为三种： 差速区带离心； 等密度区带离心； 平衡等密度区带离心。 (2)差速区带离心法该方法又称分级区带离心法，因不同颗粒的沉降速度不同而分层，故称差速区带离心法。为了获得高分离能力，在应用区带离心时需要在离心液中形成密度梯度。常用的梯度溶液是蔗糖密度梯度溶液，其主要目的是稳定离心液，避免对流，因为对流会因局部温度变化或机械振动而产生干扰，影响分离效果。差速区离心时，离心管需处于水平位置（垂直于转子轴线），离心管内的溶液应形成致密的阶梯状。需要注意的是，差分分级离心沉降法所分离的组分往往不均匀，以克服这一缺点
RCF(克)
转/分钟
30:
7000_
Bu700000
5000:
r50000
-
6000-
-600000
4500
-45000
25三
5000:
：500000
4000 -=
40000
4000 ：
-400000
：
3000 ：
:300000
3500-=
-35000
20 1
19^
2000-
-200000
3000 ：
18-
— 30000
17-
1500-
-150000
16-
15-
1000-
-100000
2500;
;25000
14-
800:
-80000
13-
m-
-70000 60000
12-
500-
-50000
2000 二
-20000
11-
400-
;40000
10-
300-
:30000
9 ：
200 -
20000
1500 ： 1400 -
L15000 -14000
8 -
150 -
-15000
1300 -
-13000
7-
100 ： 80 -
-10000
1200-
-12000
-
：8000
1100-
-11000
6 -
:騮
1000 -
:10000
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50 ：
：5000
900 {
;9000
5-
40
：4000
30 :
- 3000
800 -
：8000
4-
20 -
2000
700 -
.7000
15 -
-1500
600 -
-6000
3-
10 -
-1000
500 -
5000
糖溶液使其浓度自离心管底部至液面分布范围为10%〜40%，即造成密度梯度的分布， 越近管底密度越大。离心前把要分离的混合物小心地放在液面上成为很薄的一层，离心开 始时很慢,避免扰乱溶液的密度梯度和加样层。离心后可以分 成区带，最后停止离心。一般在离心管底部开一小孔，分别收集已经按微粒大小分布的区。
(二）平衡等密度区带离心法 此法亦称为平衡等密度离心法。 一 般使用重金属盐(例如铯或铷)来制备梯 度。样品(如DNA)和氯化铯(CsCl)的浓 溶液均匀地混合，离心氯化铯浓溶液产 生一个氯化铯的浓度梯形。由于铯离子 的质量大，因此也就形成了一个密度梯 度，然后在梯度中DNA分子进行分配。 由于离心力的作用把它们赶到了一定的 区域内，在这个区域中溶液的密度等于 DNA分子本身的漂浮密度。这方法在分 析离心中是最常用的。这种方法也已用 于分离和分析人血衆脂蛋白。
(三）梯度溶液的制备
制备液体密度梯度最常用的介质是蔗糖溶液。这种蔗糖溶液可以是缓冲的，也可以不 是缓冲的，有时用重水(D20)来代替水，这样可以得到更好的分离。
必要时，可以根据分离过程的需要来特制梯度，例如:需要高密度和低渗透压的梯度
时，可以用Ficoll(—种蔗糖和环氧氯丙烷的聚合物，分子量为400 000)代替蔗糖。Ficoll 还具有不会渗入细胞膜的优点。重金属盐如铯和铷已被用来制作高密度的梯度。由于氯 化铯具有腐蚀作用，所以含有这种物质的梯度只能在较硬的钛金属转头中使用。
制备离心管内不连续的梯度溶液方法最简便，例如欲制备5ml的4%〜20%的蔗糖溶液 各lml，先将最浓的蔗糖溶液加在离心管底部，依次将较稀蔗糖溶液小心地沿离心管壁逐一加 入，最后加入最稀的蔗糖溶液即成。这种小体积的不连续的梯度瑢液放置一定时间后，由于扩 散作用可减少不连续性，逐渐接近于线性型梯度溶液。现已有制备梯度溶液的梯度仪商品出 售，能迅速制备连续性的梯度溶液，并能同时制备多管梯度溶液，使用方便。
制备直线型梯度溶液，最简单的设备包括两个柱形容器，中间装一连通管，中间连通 管可用活塞或螺旋夹关闭或开放，两边为储存室和混合室，后者内装搅拌器，并有导液管 使混合液流入离心管。盛蔗糖溶液于两个容器内，各含有所需的顶部和底部的不同浓度蔗 糖溶液，由混合室混合的梯度溶液以导液管流入离心管内。这种制备梯度溶液的方法有 二，要根据先把浓的或稀的蔗糖溶液放在混合室中而定。
将较高浓度的蔗糖溶液放在混合室中，较低浓度的蔗糖溶液放在储存室中，这样 从混合室中流出的蔗糖溶液的浓度以线性速率减低。梯度液流出的导管口必须贴靠管壁， 使溶液从管壁流下以避免扰乱已造成的梯度。
将较低浓度的蔗糖溶液放在混合室中，较高浓度的蔗糖溶液放在储存室中，梯度 溶液流出的导管口必须与离心管最底部接触，并靠近管底中心，这样密度较小的稀蔗糖溶 液可被密度较大的浓蔗糖溶液顶浮起来，加完毕后小心将导液管取出。
梯度溶液从混合室流出的速率可用螺旋夹或流出口直径的大小而控制，不宜太快，在 (1)法中，流出速率可高至每分钟2ml，而在(2)法中应较慢，宜控制在每分钟lml。这两个 柱形室中水压应相等，这样开放其间连通管时，不致相互产生对流扰乱。
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