蛇毒蛋白的分离技术 分析性超速离心

(1)沉降速度法

在沉降速度实验中，若转速达到50000r/min~60000r/min，溶液中均匀分布的大分子会以一定的速度向离心池底部移动，而离心池顶部的溶液将仅由于溶质分子的损失而变得。带有溶剂分子的上清液层。溶液在上清液层以下浓度均匀的部分称为“平台区”。上清液层和“平台区”之间有一个过渡区。与旋转轴的距离不同，这个区域称为“界面”（b0wndary），如图3-13-16所示。沉降速度法主要是用光学的方法来测量这个界面的运动，即测量高原区溶质分子的运动。在沉降过程中，离心池到转轴中心不同距离处的溶液浓度不同，但常用的光学系统并不直接记录浓度，而是记录浓度的变化（相当于折射率的梯度变化），这种沉降图像的曲线峰形常被用来观察沉降界面的运动，以确定沉降物质的沉降系数和识别制备溶液中溶质分子的均匀性，因为沉降系数与沉降分子的大小和形状有关，所以使用该方法还需要扩散系数来测定分子量。

如果溶质分子的密度小于溶剂的密度，如浓盐溶液中的脂蛋白，在离心过程中，溶质分子会上浮，即向转轴中心移动，纯溶剂层在离心机池底部产生，因此测量得到的沉降系数将为负值，超速离心沉降线的峰值将向下。如果溶液中含有两种沉降速度不同的溶质分子，则在沉降过程中可能会出现两个界面。如果存在多个具有不同沉降速度的溶质分子，则可能出现多个界面，每个界面的运动也可以决定不同溶质分子的沉降系数。当溶液中含有大量不同沉降系数的分子时，界面区域可能只有一个，但这只代表不同沉降系数的分子连续分布。

(2)沉降平衡法

沉降平衡实验一般在低速下进行。例如，分子量在60000左右的蛋白质分子的沉降平衡实验只需要8000Or/min。扩散是由浓度梯度的产生引起的，因此向相反方向移动的两个溶质分子的数量很可能在适当的时间相等并达到平衡。

沉降实验开始时，由于溶质分子的沉降，液面浓度降低，离心机底部浓度升高，但由于溶质分子向相反方向扩散，不像沉降速度法实验那样离开液面而产生上清液层，而是在液面上保持一定的浓度。

在沉降平衡初期，离心池中心（高原）附近的溶液浓度与距转轴中心的距离无关。事实上，它与原始浓度（c）相同。随着实验的进行，平台逐渐消失。只有一个地方的浓度与原来的浓度相等，经过很长一段时间后终于达到平衡状态，离心池中各部分的浓度不再随时间变化。

在理想的沉降平衡条件下，终液面浓度为原浓度的一半，离心池底部浓度为原浓度的2倍。通过测量沉降平衡时溶质浓度的分布可以直接计算出分子量，不需要扩散系数。这与沉降速度法不同，但都需要溶质分子的微分比容数据。这种方法的理论基础很好，但达到沉降平衡需要很长时间，有些实验需要好几天，这是它的缺点。

近年来，由于技术的改进和理论的进步，Archibald在沉降初期还存在平台区的情况下，利用液面附近和底部附近的浓度梯度曲线直接计算分子量，可以节省大量时间平衡。这种新方法有可能与沉降速度法一起常规使用。

(3)沉降系数和分子量的测定

在沉降速度实验中，溶质分子远离旋转轴的中心I。如果转子的旋转角度为质心，则离心加速度是作用在溶质分子上的离心力与其有效质量的乘积，有效质量是其真实质量减去它所排开的介质的质量。如果M是溶质的分子量，F是溶质分子的微分比容，P是介质的密度，