蛇毒中神经生长因子

与蛇毒中的其他活性物质相比，神经生长因子（NGF）是最令人费解和感兴趣的一类物质。现在已知NGF是一种调节交感神经元生长分化的物质，有时对感觉神经组织的生长分化也有一定作用。从蛇毒中发现NGF纯属偶然。有人观察到NGF对神经生长的刺激作用。该方法是将能够产生NGF的小鼠肉瘤细胞180移植到发育3天的鸡胚胎中。当时，NGF的性质还不清楚。是蛋白质或核蛋白。为确认是否为核蛋白，实验中将具有核酸外切酶活性的粗蛇毒成分加入鸡胚中，目的是去除核酸，从而确定NGF是否为核蛋白，意外发现添加的蛇毒成分本身就含有NGF。

NGF分布广泛，各种哺乳动物组织中均有这种物质，其中雄性小鼠额下腺中NGF的含量最高。现在已知眼镜蛇毒和毒蛇毒中NGF的含量高于响尾蛇毒，海蛇毒无NGF活性。蛇毒中NGF的含量很难准确测定，低于0.5%，但远高于一般组织中的含量。其他动物毒物如蜂毒、蝎毒、蜘蛛毒和蟾蜍毒均不含NGF。

NGF一般不具有酶活性，只有少数具有蛋白酶和RNase活性，但这些活性似乎与NGF的功能无关。有些试剂或条件可以使酶活性消失，但NGF的生物活性仍然存在。纯NGF 没有毒性。

(―) 响尾蛇毒液NGF

所有响尾蛇毒液似乎都含有NGF，东部菱形响尾蛇和鱼尾藻毒液NGFa 的研究最多。以蛇毒为原料，初步分离纯化NGF。纯化过程包括硫酸铵沉淀和DEAE-纤维素、DEAE-纤维素层析。特别是在分离过程中，将粗毒物溶于7.5 mol/L尿素的1 mmol/L NaOH中，在（）下放置90 min，然后用（NH 4 ） 2 SO 4 沉淀。如果不进行这样的处理，在后续的层析过程中，NGF会大量失活。上述处理过程会引起NGF的氨基甲酰化，而这种修饰是由尿素中的氰酸盐杂质引起的。这种修饰使NGF的生物活性在后续的分离过程中不易丧失。上述提纯后的NGF基本为纯品，超速离心分析S2为2.28，由此推导出的分子量为20000。该组分的E=10.3，280nm和260nm处的紫外吸收光比（ 280nm /260nm) 为1.3。分析还表明，该NGF 含有1.6% 的己糖。纯化的NGF生物活性是小鼠肉瘤180细胞NGF生物活性的1000倍。该因子对热不稳定，在0.1mol/LNaOH 261：条件下，lh的生物活性没有改变，但原有的RN酶和蛋白酶活性完全消失。不易通过半透膜，经RN酶和DN酶处理不失活，但不被胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶灭活。胰凝乳蛋白酶处理会降低或失去生物活性。 Banks等人纯化的蛇毒NGF的特性。 (1968) 与Cohen 等人纯化的NGF 不同。 （1959）。安杰莱蒂等人。纯化了毒物NGF，并研究了其理化性质。蛇毒NGF的纯化过程比较复杂，好像有好几种NGF。蛇毒NGF的分离类似。纯化后的NGF用凝胶过滤法测定分子量时发现，得到的成分不是单一的，主要成分的分子量为30000。除了上述三种响尾蛇毒外，以下NGF响尾蛇毒液还获得纯化或部分纯化的： 西部小菜蛾(C.aZmr)、通头府、虹口军和矛头蛇。前三种蛇毒仅用SephadexG-100进行色谱分析，虽然色谱图不同，但其NGF活性均出现在2000040000的分子量范围内，说明响尾蛇毒液中NGF的分子量相近。凝胶电泳和氨基端测定仍不是纯品，含Ser和Gly两个氨基端，活性成分分子量34000，等电点10.5。有趣的是，如果用神经氨酸酶处理分离出的NGF，结果发现所有蛋白电泳条带的电泳速度都发生了大约30%的变化。这种变化可能与分子中唾液酸的去除有关，因此A蛇毒NGF是一种糖蛋白。用QAEA-25、SPC-25和SephadexG-100对蛇毒中的NGF进行分离纯化后，凝胶电泳检测分离出的NGF仍不纯，两种主要成分的等电点分别为8.0和分别为9.0。类似于蛇毒NGF，它们含有大约12% 的糖，包括N-乙酰葡萄糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖。凝胶过滤得到的NGF分子量为35000，SDS-PAGE得到的分子量为19000，表明NGF可能以二聚体形式存在。

(2) 蝰蛇毒NGF

蝰蛇毒液中也含有NGF，其中来自蝰蛇毒液的NGF研究较多。从蛇毒中纯化的NGF，在pH3.8和pH5.2条件下进行圆盘电泳测定为蛋白条带，等电点为10.5，超速离心和测定其分子量分别为37000和34000。分别进行凝胶过滤。分子形状拉长，轴比为1:7，分子无聚合现象。这种NGF最大的特点是含有20%的碳水化合物，包括4个果糖、8个甘露糖、9个半乳糖、14个N-乙酰氨基葡萄糖和2个N-乙酰神经氨酸。分子中含有大量的谷氨酰胺和天冬酰胺，是一种碱性蛋白质。银行等。 (1968)对蛇毒NGF的研究发现，蛇毒NGF有3种，等电点在9.511.0之间，沉降系数分别为2.92、2.83和2.88，分子量分别为42000、38000和39000，它们的两个N端都含有一个组氨酸残基。从蛇毒中分离出的NGF相当稳定，0.1mol

/L HC1或0. lmol/L NaOH 不会引起失活，也不被胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、DN酶和RN酶水解，对EDTA透析也不 影响其生物活性，但胃蛋白酶或9CTC加热，15min可以使其生物活性全部丧失。Bailey等 (1975)从沙蝰蛇毒中分离的NGF用凝胶过滤法测定分 子量为34 000,等电点为8. 5。尽管用凝胶过滤法测定为纯品，但氨基末端测定含有多种 氨基酸,其中含量最多的是异亮氨酸。这种NGF的含糖量高达32%,其中包括3. 2%甘露 糖、2. 8%半乳糖、13. 8% N-乙酰葡萄糖胺和7. 5%的唾液酸。May等（1959)和Mohamed等（1971)分别对毒蝰、锯鱗蝰和彩锯鳞蝰蛇 毒NGF进行了研究，结果表明，后两种蛇毒中NGF的含量较高，而蛇毒NGF的含量较少。

(三）眼镜蛇毒 NGF

在眼镜蛇毒中，印度产的眼镜蛇蛇毒含NGF较多，而且分离也比较容易， 所以在研究蛇毒NGF的性质时多以此毒中的NGF为材料。蛇毒NGF容易分离 的原因在于它对pH的变化不敏感，对许多变性剂也有抗性。分离蛇毒NGF — 般通过两步就达到目的，          第一步使用Sephadex C-25凝胶过滤，          第二步用CM-Cellulose 进行离子交换层析。纯化后的NGF用沉降平衡法测定其分子量为28 000,用SDS-PAGE 法测定分子量为13 000,这说明该分子是由2个相同或相似的亚基组成，其他实验也证明 是由2个相同的亚基组成。毒NGF的等电点为6. 7,这可能因为分子中含有酸性 糖的缘故，它的分子大小、氨基酸组成以及在体内外的生物学活性都与鼠颌下腺的NGF 相似。

从其他眼镜蛇如黑颈眼镜蛇.黑唇眼镜蛇绿曼巴蛇毒中也纯化出了 NGF。其分离、纯化过程相似，都是先用Sephadex G-50凝胶过滤，然后用SP-Sephadex C-25离子交换层析。对于从 毒NGF的纯化还要经过          第三步——Sephadex G-100凝胶层析。这3种来源的NGF都不 十分纯净。从蛇毒中纯化的 NGF分子量分别为22 000、22 000和34 000,等电点分别为9. 0、8. 0和10. 0,它们的含糖量均 小于2%，甩神经氨酸酶处理不影响其电泳特性。

雷少波等（1981)采用 Sephadex G50、CM-Cellulose 32 及 Sepharose 6B 柱层析，自中 华眼镜蛇毒中分离出神经生长因子(NGF)。经3种不同类型的聚丙烯酰胺凝胶电泳及免 疫鉴定证明纯化的NGF为单一组分。此NGF经9天鸡胚背根神经节体外培养证明具有 促进神经节神经纤维生长的活性。经Sepharose 6B凝胶过滤及SDS凝胶电泳测得其分子 量分别为27 000及13 700,故推测中华眼镜蛇毒NGF可能由2条分子量相同的肽链组 成。NGF的等电点为7.1，氨基酸组成与印度眼镜蛇毒NGF部分相似。用体外整体神经 节培养法鉴定NGF活性时，纯化的中华眼镜蛇毒NGF在培养基中浓度为0. 0lMg/ml时 可使神经节神经纤维生长达较大速度。这一浓度与小鼠颌下腺NGF及印度眼镜蛇毒 NGF所需浓度一致。在不纯时，印度眼镜蛇毒NGF活性受毒素的抑制而不能促进神经节 神经纤维的生长。而中华眼镜蛇毒NGF即使在粗毒状况下也表现出生物学活性。这可能 因不同地区蛇毒中各种组分含量不同，因而对于NGF生物学活性影响不同。采用 Sepharose 6B柱层析测得中华眼镜蛇毒NGF的分子量为27 000,而采用SDS凝胶电泳 测得NGF的分子量为13 700,故推测中华眼镜蛇毒NGF也可能由2条分子量不相同的 肽链组成，但有待于氨基酸顺序分析证实。

从NGF的氨基酸组成结果看，中华眼镜蛇毒NGF与蝰蛇毒NGF及小鼠颌下腺 NGF在氨基酸组成上相差较大，但与印度眼镜蛇毒NGF氨基酸组成却较近似，这是因为 中华眼镜蛇与印度眼镜蛇同属于眼镜蛇科，故其蛇毒成分相似。但中华眼镜蛇毒NGF分 子内碱性氨基酸如组氨酸、精氨酸及赖氨酸含量稍多，而天门冬氨酸及谷氨酸等酸性氨基酸含量稍少，这与测得NGF等电点为pH7. 1，较印度眼镜蛇毒NGF等电点为pH6. 7稍 偏碱相符合。