蛇毒蛋白分离技术增溶溶解方法

任何要纯化的蛋白质都需要溶解，因为所有分离步骤通常仅在水溶液中进行。在某些情况下，溶解涉及简单地破坏含有待分离蛋白质的细胞，而在其他情况下，它还可能包括从亚细胞器中提取蛋白质。增溶和溶解的方法有很多种，但选择的方法必须考虑到待破碎细胞的特性和待分离蛋白质的性质。例如，如果要分离的蛋白质位于线粒体等细胞器中，目标是先分离线粒体，然后从纯化的线粒体中溶解蛋白质，因此需要考虑使用非常温和的方法破坏线粒体。细胞。防止损伤细胞器。如果目标只是破坏细胞并溶解蛋白质，而不管它存在于何处，则可以使用更粗略的方法。样本量是另一个严重影响增溶-溶解方法选择的考虑因素，在处理几千克酵母或牛肝时，用于破坏几毫克培养动物细胞的方法几乎没有用处。各种增溶和溶解方法简述如下：

(1) 细胞穿透

透化细胞是破坏细胞的最温和的方法之一。这种方法是通过将细胞置于低渗状态并施加温和的破坏力来实现的，例如将细胞吸入移液管中。这种方法的温和性质限制了它对只有膜并作为单细胞存在的细胞类型的应用。而对于那些细胞壁坚硬、含糖的细胞，如细菌、植物、霉菌等，这种方法就没用了。如果首先通过酶法去除这些微生物的细胞壁，也可以使用此方法。对于大肠杆菌，溶菌酶可有效去除其细胞壁，而对于几种酵母，葡萄糖酶（硫酸酯酶和葡糖苷酶的混合物）具有活性。除了应用上的局限性，该方法只能用于稀溶液中的少量样品，因此，该方法不能用于大分子的大规模纯化，但可用于分离各种细胞器或少量不稳定的大分子，如作为mRNA 等待。当用这种方法纯化核酸时，添加去污剂可能有助于破坏细胞并保护核酸免受酶促破坏。

(2) 组织匀浆器

玻璃组织匀浆器是最温和、最常用的细胞破碎方法之一。有手动操作的组织匀浆器和电机驱动的组织匀浆器两种类型。玻璃组织匀浆器有多种尺寸可供选择，适用于1 毫升至50 毫升的样品体积。使用前，选择合格的组织匀浆器非常重要。经常有不合格的，不是太松就是太紧，造成均质效果差或操作困难。玻璃组织匀浆器常用于粉碎动物器官中的细胞，如肝脏和胸腺，不能用于粉碎细菌。有时加入细玻璃珠（直径45/xm55um）混合研磨，但玻璃珠会吸附一些蛋白质，效果不佳。

(3) 组织捣碎器

组织捣碎器是粗细胞破碎的常用方法之一。大小规格多样，速度可调。在破碎细胞的过程中，样品必须保持冷冻状态，因为连续工作30s~45s以上，温度肯定会升高（10以上）。 Tissue pounding Crusher 常用于植物和动物组织的粉碎，但不用于细菌。如果使用浓稠的菌悬液，并按其体积的1/3 至1/2 添加玻璃珠，可能会改善对细菌的粉碎。此时菌体并不是被捣碎器的刀口压碎，而是因为夹在中间的玻璃珠和菌体相互碰撞破碎，但不常用。

(4) 声细胞破碎机

超声波细胞破碎仪或超声波振荡器是破碎细胞或细胞器，尤其是细菌最常用和最有效的方法之一。有时最好先用溶菌酶处理，再超声破碎。超声波细胞破碎仪通常由两个主要部件组成： 高频电发生器，产生高强度超声波信号； 电力发射器，向与其接触的溶液发射超声波。即超声波引起的冲击和振动导致细胞破碎。各种尺寸的探头选择使得超声波振荡器适用于从几毫升到1 L 的样品体积。主要缺点是电力转换器中产生的大量热量。因此，必须仔细监测样品的温度，并且必须将超声波细胞破碎仪的振荡时间控制在最低限度。必须采用冷却处理和间歇超声处理，保证样品温度控制在10以下。超声波细胞破碎仪在国内市场上有售。

(5) 挤出机

挤压器可用于捣碎微生物。国外主要有三种挤出机型号： 休斯挤出机； 法式挤压机； 伊顿挤出机。这三个挤出机的作用是在1.78X104N~3.56X104N的压力下迫使少量（5ml~10ml）细胞悬液通过一个小孔。 French和Eton squeezer的开口是6mm或者更小的孔，Hughes squeezer的开口是两块平板之间有一个很小的距离，细胞通过小孔就被撕裂了。挤出机方法温和彻底，但其应用受限于其可容纳的样品体积有限。

(6) 亚细胞成分蛋白质的增溶

许多蛋白质与亚细胞成分（如细胞膜）结合。分离亚细胞成分后，必须溶解蛋白质，这是纯化此类蛋白质的先决条件。对于松散结合的蛋白质，通常将亚细胞组分悬浮在离子强度高的溶液中就足够了，常用5mol/L~6.5mol/L KCl或NH4Cl溶液。然而，此类溶液对于结构蛋白以及具有催化功能的蛋白质（例如牢固结合的膜蛋白）的释放无效。这时必须使用低浓度温和的离子型洗涤剂或非离子型洗涤剂，如脱氧胆酸钠、Triton化合物等，有时还要结合使用温和的超声波帮助打散亚细胞结构。