蛇毒中作用于羧酯键的酶

蛇毒中含有水解羧基酯键的酶，水解底物为磷脂、乙酰胆碱和芳香族醋酸酯。这类酶包括：三种，即磷脂酶、乙酰胆碱酯酶和芳香酯酶。蛇毒中的精氨酸酯酶虽然也能水解人工合成的精氨酸或赖氨酸酯，但主要水解自然界中蛋白质的肽键，因此属于蛋白酶类。这里讨论的酶只作用于酯底物，而不作用于任何肽键。在这些酶中，乙酰胆碱酯酶和磷脂酶的生物学功能更为重要，已被充分研究。有些蛇毒具有很强的芳香酯酶活性，能水解对硝基苯乙酯、-或对萘乙酸酯和吲哚乙酯。目前尚不清楚这种活性是由单独的酶产生的还是已知羧酸酯酶的副作用，更不用说这种酶的生物学意义是什么了。日本白花蛇毒与底物对硝基苯乙酯和吲哚乙酯反应，未发现水解产物对硝基苯酚和吲哚酚；相反，如果这些酯与眼镜蛇舟山亚种混合。环蛇毒液会迅速水解。已知这些眼镜蛇毒具有很强的胆碱酯酶活性，上述底物的水解可能是由于这种酶的作用。事实上，Mclean 等人。 (1971) 报告说，眼镜蛇科的一些蛇毒会水解吲哚乙酯、萘乙酯和萘酯，它们来自：眼镜蛇、黑颈眼镜蛇、黑唇眼镜蛇、金色眼镜蛇、埃及眼镜蛇、眼镜王蛇、环蛇曼巴蛇、黑曼巴和白唇曼巴(D.

蛇毒能水解甲基吲哚乙酯，甲基吲哚乙酯是测定血清中胆碱酯酶活性的底物，但这种蛇毒没有表现出胆碱酯酶活性。这说明眼镜蛇毒液中存在着一种与胆碱酯酶不同的未知酯酶。要找出这种酶的本质，还需要进一步的分离工作。

1.磷脂酶A2

（-） 概述

磷脂酶是指能够水解磷酸甘油酯的酶。自然界中有5种磷脂酶，即磷脂酶A2、磷脂酶

A、磷脂酶B、磷脂酶C和磷脂酶D。蛇毒主要含有磷脂酶A2（PLA2），极少数蛇毒含有磷脂酶B，其他磷脂酶主要存在于动物组织和细菌中。图3-11-4 说明了这些磷脂酶对底物水解的作用位点。

在磷脂酶中，PLA2研究较多，可能是蛇毒中研究最多的酶。它的底物是Sn-3-磷酸甘油酯第二位的酯键。这种酶广泛存在于蛇毒、蜂毒、蝎毒和动物组织中，四大家族的蛇毒都富含PLA2。由于这种酶破坏红细胞而引起溶血，故又称“溶血素”，也有人称PLA2溶血卵磷脂酶。

Ludeeke首先发现蛇毒可以通过酶作用于卵磷脂产生溶血性化合物。后来，Delezenne 等人。证明眼镜蛇毒作用于马血清或蛋黄时形成溶血物质。现在已知PLA2可直接作用于红细胞膜的磷脂，破坏红细胞膜的结构，引起直接溶血；也可作用于血清或添加的卵磷脂产生溶血卵磷脂，作用于红细胞产生间接溶血作用。虽然四大家族的蛇毒都富含PLA2，但各种蛇毒中的酶含量略有不同，响尾蛇（C.

蛇毒仅显示微弱的PLA2 活性。表3-11-11举例说明了我国10种主要毒蛇毒的活性比较。

表3-11-11 我国10种蛇毒中磷脂酶82活性比较

蛇毒

释放脂肪

脂肪酸，

Cjumol/毫克）

溶血活性CHU50/^g*ml)

蛇毒

释放脂肪酸。

(^raol/毫克)

溶血活性" (HU50/ftg*1111)

Najanajaatra

9.62

11

小头虫

5.10

卡利斯帕拉斯

8.68

2800

纤细的

/p>

V, acutus

7. 56

* * #

Ophiophagus hannah

3.82

140

Bnugarus fasctatus

7,56

280

B. multicinctus

1.96

280

Viper a russelli

7.03

 

T, mucrosquamatus

1.85

 

Siamensis

 

 

T. stejnegeri

0. 97

 

 

 

(二）分离和纯化

蛇毒中PLA2的含量较大，而且对热、酸、碱和变性剂稳定，这样使它们很容易被纯 化分离PLA2常用的方法是先对粗毒进行凝胶过滤，然后进行离子交换层析，后一步可 以重复进行。需要注意的是，在离子交换层析后对PLA2进行冷冻干燥应该注意不要引起 的聚集，因为冷冻干燥过程中往往使体系中离子强度增大，而离子强度大是引起 PLA2聚集的重要因素。除上述一般方法外，下面一些方法也有被采用:①Wells等(1975) 用异丙醇和NdCl3沉淀法从东部菱斑响尾蛇 如蛇毒中纯化出了 PLA2。②用PLA2的底物类似物为配基进行亲和层析。这种配基可以与蛇毒中结合有Ca2+的PLA2结合。洗脱液多采用EDTA，除去Ca2+后的PLA2与配基 的亲合力减小，可以从配基上解离出来。也有人用30%的有机溶液或6mol/L尿素作为洗 脱液。③用PheiiylSephar0SeCL-4B进行疏水层析，以除去心脏毒素中的微量PLA2。④ 以抗PLA2的抗体作配基对PLA2进行亲和层析。

迄今为止已经有大量的蛇毒PLAZ被纯化出来。Tu等(1977)列出了 1975年以前从 蛇毒中纯化出的PLA2。近几年，每年都有大量报道分离、纯化PLA2的文章，在这里着重 讨论我国学者对PLA,的分离纯化工作。

陈远聪等(1981)从浙江蝮蛇毒中分离出3种PLA2，按其等电点划分，可分为酸性、中 性和碱性PLA2。按其毒性划分，毒性较大的是中性PLA2，已鉴定为突触前神经毒素—— 蝮蛇毒素(Agkistrodotoxin),毒性较低的是碱性PLA2,酸性PLA2几乎没有毒性。武祥福 等(1984)比较了 3种PLA2的特性，包括分子量、氨基酸组成、N末端、等电点、热稳定性、 酶活性、毒性和溶血活性等.结果表明，它们有相似的分子量和热稳定性，但在其他方面却 有显著的差别。在酶活性方面，酸性酶活性较高，碱性酶活性最低;对大白鼠红细胞的溶血 作用碱性酶最强，中性酶次之，酸性酶几乎不溶血。因此推测PLAZ的溶血效应与PLA2 分子的电荷有关。张景康等（1981)已经制出了 Agkistrodotoxin的晶体。涂光俦等 (1983)报道从福建产圆斑蝰蛇毒中分离纯化了一个等电点为7. 6的毒性PLA£，并测定了 它的部分理化性质、氨基酸组成及N-端22个氨基酸残基的排列顺序。李跃生等(1985)从 福建产圆斑蝰蛇毒中分离纯化出另一种PLA2。该PLA2*子量为13 800,等电点10. 4,比 活力为35/xnioI/miri . mg。以卵磷脂为底物，酶的最适pH为8. 0,最适温度为65°C。小鼠 静脉注射的LD5。为0. 5士0. 12mg/kg。此酶具有明显的抗凝性和溶血作用。该毒性PLA2 分子由18种氨基酸的123个残基组成，分子中富含半胱氨酸(14)、天冬氨酸(14)和甘氨 酸(12)，但只含1个甲硫氨酸，其N末端为丝氨酸残基。与涂光俦分离的PLA2相比，2种 同工酶的分子量和氨基酸残基数目十分相近，氨基酸组成也很相似，但天冬氨酸和脯氨酸 残基的数量有一些差异。广西眼镜王蛇 蛇毒含有丰富的PLA2,舒 雨雁等(1989)从该毒中分离出一种PLA2,比活性较原毒提髙3. 6倍，分子量为13 000, 由122个氨基酸残基组成，等电点为8. 9,具有良好的热稳定性。从碱性PLA2对红细胞影 响的电镜观察可见，对人的红细胞膜有明显的作用，而对山羊红细胞作用不明显，该 PLA2无论对人还是对山羊、兔和豚鼠红细胞电泳速度都有明显的迟缓作用。Chen等 (1989)最近从尖吻蝮 蛇毒中分离出一种酸性PLA2,用凝胶过滤测 定的分子量为16 900，SDS凝胶电泳测定的分子量为16 400,等电点为4. 9,该酶N端的10个氨基酸顺序与从响尾蛇科其他来源的PLA2相似。该酶能抑制由ADP、胶原蛋白和 花生四烯酸钠诱导的血小板聚集，当PLA2浓度在10/xg/ml〜lOOjug/ml时，血小板聚集 彻底被抑制。如果用洗涤的血小板为材料，PLA2在20Mg/ml浓度也不能抑制聚集。阿斯 匹林是环氧酶的抑制剂，可以抑制PLA2对血小板的作用，PLA2可能是通过水解出花生 四烯酸合成血栓素A2来抑制血小板的聚集作用的。用圆二色性、荧光、紫外光吸收等手 段研究了浙江产蝮蛇毒碱性PLA2的溶液构象，实验结果显示此酶的主链构象和其他种 属来源的同类酶相似，骨架构象具良好的抗热性，在酸性环境中产生的构象变化为可逆 的。激活剂Ca2+和酶的结合不影响色氨酸残基的环境，抑制剂，Zn2+则与此相反。溶液pH 值影响酶活性的方式与上述试剂不同。

在蛇毒PLA2纯化过程中一个明显的现象是一种蛇毒中含有2个或2个以上的 PLA2洗脱峰。这种现象有如下几种解释:①由于存在同工酶引起;②一种PLA2通过自身 聚合成为多种分子量大小的PLA2混合物，其分子量多在9 000〜40 000范围内；③ PLA2与其他蛇毒组分结合使PLA2复杂化;④由于PLA2中的酰胺键被水解引起电荷的 改变。①和②两种情况普遍存在，只有少数例外，如CrWa/w蛇毒中的PLA2就不会

出现①和②两种情况。已经发现的          第③种情况见于下列蛇的蛇毒中的PLA2:泰攀蛇 (Oxyuranus scutellatus)、异澳蛇（Parademansia microlepidota)、矛头複（Bothrops a^>er)、巴勒斯坦蝰蛇 、沙蝰 、恐怖响尾蛇 .km。

  第④种情况的结果使PLA2在电泳过程中迁移速 度发生变化，但氨基酸组成没有改变。肽链可以因为被水解而断裂，但一般地说仍然被二 硫键联结在一起。东部萎斑响尾蛇蛇毒含有两种形式的PLA2，分 别称之为a型和p型PLA2，这两种PLA2仅是一个氨基酸之差，即一种PLA2分子中的谷 氨酰胺在另一种PLA2中被谷氨酸取代。尽管对于这种差别的确切原因还不清楚，但一般 认为与PLA2被脱去氨基有关。巴勒斯坦蝰蛇 蛇毒中的PLA2如与粗毒 一起保温，其酶分子中竣基会变得比原来多。从C.蛇毒中分离出的PLA2具有两种不同的N端，其分子量为30 000。这种现象可能因为该PLA2以不对称的 二聚体形式存在所致，与东部菱斑响尾蛇 和西部菱斑响尾蛇 蛇毒中PLA2形成的对称二聚体相似。亚洲眼镜蛇 是由许多亚种组成，有些 在分类上还不十分确定。例如过去所说的眼镜蛇外里海亚种  现在认

为应归于外里海眼镜蛇 。由于亚种繁多，而且相互混在一起，这样使蛇毒的组 成因来源不同而相差很大，PLA2同工酶含量也较多。例如眼镜蛇   蛇毒

中就至少发现9种r^ll种PLA2同工酶，眼镜蛇外里海亚种 蛇毒中 发现存在7种同工酶。Durkin等(1981)对不同类蛇毒中PLA2含量和同工酶数量进行了 研究，包括18种眼镜蛇毒，3种曼巴属蛇毒，5种蝰蛇毒，16种响尾蛇毒和 3种海蛇毒。总的来说眼镜蛇毒PLA2活性高，同工酶多，蝰蛇毒PLA2活性和同工酶种类 中等，曼巴属蛇毒和响尾蛇毒PLA2的活性很低或没有PLA2活性，海蛇毒PLA2活性也 较低。

近些年来，不人报道蛇毒中的PLA2以活性二聚体形式存在，如东部菱班响尾蛇 (C.蛇毒中含有a型和P型PLA2,均由两个相同亚基组成，仅二聚体酶才有

活性。Shen等也提出该蛇蛇毒的PLA2只有二聚体是酶的活性形式。空间结构的研究也 证明西部菱斑响尾蛇 的PLA2以二聚体形式存在。食鱼複

蛇毒有两种不同的PLA^Ei和E2,其中仏以二聚体形式存在，二聚体有活 性，其解离后的单体无活性。路英华等(1980对E的理化性质和反应动力学进行了进一 步的研究。Jayanthi等(1989)从圆斑蝰 蛇毒中分离出一种碱性PLA2(VRVPL-V)，单体PLA2的分子量为10 000,具有致死、抗凝和水肿作用。该酶在PH4. 8 条件下可以聚集成不同分子量的聚合体，随着温度的升高聚合程度也增大，聚合物的分子 量也增大。在96°C条件下生成的聚合物分子量为53 100,这种聚合物PLA2活性增大两 倍，而神经毒性消失。聚合态的PLA2抗凝活性增加，但水肿作用降低。Theodro等 (1985)用荧光素异硫氰酸盐为标志物证明从印度眼镜蛇蛇毒中分离出 的PLA2在测定活性的条件下也以聚合物的形式存在。这方面的例子还有很多。