木耳菌种分离新方法简介

近年来，由于山区采矿和城市建设，真菌种类日益减少，真菌种质资源的采集、保存和研究成为必不可少的基础工作。但是，一株优良的菌种经过多年的扩产和使用，其优良特性会严重退化，必须重新分离和再生。为保证菌业的正常发展，不断选育优良菌种势在必行。传统育种品系大多采用组织分离法进行分离，多采用鲜穗直接分离或干穗用水浸泡后分离。目前也采用干耳法进行分离，但工序复杂，所用药物较多，条件差的地方很难做到。由于各种药物的作用，即使分离成功，菌丝的萌发和生长也很缓慢。黑木耳的耳瓣较薄，富含明胶，因此以往的分离方法很少采用耳瓣组织分离。该方法克服了现有干耳菌分离方法存在的操作复杂、成本高、菌丝分离成功率低、质量差的缺点，是一种操作简单、用料少（包括药物）、成本低的方法。菌丝发芽快、生长旺盛、致密、分离成功率高干果穗组织分离法解决了真菌常规分离方法中的一系列技术难题，为广大制种工作者提供方便。 1 测试材料1.1 耳机的来源将来自江西省分宜县大岗山、海南省陵水县吊罗山、海南省昌江县霸王岭、重庆师范大学、重庆市、黄鹤2008年湖北省武汉市高塔。黑木耳[Auricularia auricula (L.ex Hook.) Underw.]、Auricularia polytricha (Mont.) Sacc.]和皱木耳(Auricularia delicata (Fr.) Henn.)标本带回室内阴干或28烘干，干燥后用于菌株组织分离。 1.2 培养基制备分离介质：20g麦芽精粉，18g琼脂，1000mL水，自然pH值。分离液煮沸后，趁热放入5mL离心管中。将培养基做成斜坡备用。 .纯化培养基：麦芽精粉20g，葡萄糖20g，琼脂18g，磷酸二氢钾3g，水1000mL，自然pH。纯化后的培养基煮沸后，趁热放入500mL锥形瓶中，用牛皮纸密封，122高压灭菌20min。灭菌后，趁热移至无菌超净工作台，分装于60gm1.3cm板中，液体体积为13mL，平放板，待培养基冷却后方可使用。 2 组织分离法2.1 材料准备选用野生或栽培的花大、肉厚、无筋或少筋、色泽正、无霉变、无病虫害的干木耳1块，置于无菌超净工作台中。为每个标本准备10 管倾斜培养基。 2.2 设备准备组织分离所用工具为剪刀和镊子，使用前可在酒精灯火焰下消毒。 2.3 组织分离纯化培养2.3.1 干木耳的消毒和润湿在超净工作台上，用75%酒精棉球擦拭干木耳表面23次，用酒精棉包住耳朵约2分钟。 2.3.2 剪下耳承的组织片用消过毒的剪刀剪掉耳承周围的边缘，将耳承最平坦的部分剪掉远离耳根的无筋部分，得到约0.5的组织片厘米长，0.2 厘米宽。 2.3.3 组织块灭菌用消过毒的镊子夹起组织块在酒精灯火焰外焰上快速来回穿梭2-3次，每次1-2s。 2.3.4 分离培养取1/31/2组织块置于5mL离心管中斜面分离液中下部；上述整个过程必须遵循无菌操作。将接种好的离心管插入离心管盒（32管/盒）中，置于25恒温培养箱中培养。 2.3.5 纯化培养分离培养5-6天后，挑取新长出的菌丝作为接种物，接种于纯化培养基中进行纯化培养。 3 结果与讨论组织分离2-3天后，生长旺盛的组织中可见白色蓬松的菌丝，分离成功率达95%以上。

在用干耳组织隔离的过程中，如果有污染，那只是细菌污染，几乎没有霉菌污染。因此，可在分离培养物中加入100ug/mL的青霉素钠，以增强培养基抗细菌污染的能力。”另外，在转管时，如果不小心挑到被细菌污染的菌落，细菌会在一段内生长旺盛。转管后几天，菌丝无法纯化，因此，转管时，将接种块插入培养基中（最好是平板），接种块露出培养基表面1/3即可，使菌体在培养基中生长，长出表面时，菌丝的生长势明显强于细菌。培养1周左右，待菌丝长到无菌区，然后再次转管，即可得到纯菌丝体，试验所用的纯化培养基营养丰富，更适合真菌菌丝体的生长，接种于60cm平板培养基上，菌丝体最强壮生长势在25恒温培养条件下6天可长满。平板得到大量纯菌丝体，菌丝体生物量鲜重达176.9mg/13mL，干重达70.8mg/13mL。中长需要10天，弱长需要10天以上才能盖盘。该方法与传统的真菌组织分离方法相比，主要有以下优点：该方法简单，节省材料。只需要一小块耳机就可以成功分离出所需的菌株，并且可以更稳定地保持原有的菌株。特征。 、分离效率高，操作时间短，无需用酒精或汞酸长时间浸泡木耳块，只需用75%酒精棉球擦拭干木耳表面23次，用酒精棉布包裹耳片约2分钟，然后将耳片纸巾块在酒精灯火焰外焰快速来回穿梭23次，短时间内即可达到彻底消毒的效果时间。现有的真菌组织分离方法大多采用氯化汞进行消毒处理，对周围环境有害，对真菌也有一定的不利影响。用氯化汞消毒后，需要用水反复冲洗；但如果干木耳过湿，切块后耳组织块，由于缺少

　　③、耳片经晒干已杀灭部分杂菌，经上述再处理，消毒较为彻底，组织块接种在母种培养基上时，很快吸收无菌水分、使耳片膨胀恢复萌发菌丝能力，分离成功率高达95%以上（常规分离法最高的分离成功率仅为80%左右），菌丝生物量高。

　　方法操作简捷，生产成本低，菌种分离成功率高，菌丝萌发快、长势强、浓密，适用于野生及栽培的黑木耳、毛木耳或皱木耳等多种胶质耳的组织分离，应用范围较广。