双孢蘑菇的菌种保藏

蘑菇菌株与其他微生物一样，具有稳定的遗传性和变异性。遗传保证了微生物自身性状的相对稳定性，即在无性繁殖过程中能保持原有性状，为菌种的保存提供了优势。因此，变异性导致微生物在繁殖过程中的性状发生一定的变化，给菌种保藏带来困难。由于变异的存在，即常发生所谓的菌种退化，主要是指失去理想性状，导致发育缓慢、成活率和产量品质下降等。菌种保藏工作是将菌种变异降到最低程度，使菌种在经过长期保存后，仍保持原有的生命力，优良的生产性能、形态特征，无杂菌污染和虫害发生。可长期用于生产和研究。微生物的突变速度通常与其代谢速度有关。微生物代谢活性强，突变速度快，而代谢活性弱，突变速度慢。并且在多次无性繁殖的过程中可能会积累突变。利用这一规律，人们可以创造各种条件，使微生物活动减弱或不活跃，从而减少变异的发生。菌种保藏的原则是通过低温、干燥、隔绝空气、切断营养等手段，使菌种的代谢强度降到最低，抑制菌丝体的生长繁殖。由于细菌的新陈代谢比较静止，生命活动会处于休眠状态，所以可以长期保存。

2、保存方法

(1)倾斜冰箱保鲜法

这是一种蘑菇菌种的短期保藏方法，因为简单易行，不需要特殊设备，可以随时观察菌种保存情况，所以也是一种常用的菌种保藏方法。

1、保鲜方法蘑菇菌种在倾斜冰箱中的保鲜一般可以使用PDA slant medium。移植菌株后，在22-24C 的温度下培养。需要经常检查。当菌丝生长旺盛到试管时，及时选择无污染的培养坡度，用硫酸纸包好卫生棉条，置于4的室内。存放在冰箱中。通常每2-3 个月一次。

2、注意事项：由于斜面冰箱保存是在4下进行的，单孢子菌的活性没有停止，需要经常换管。 1、菌落特性应保持原有特性。操作人员必须具备一定的辨别坡上菌种品质的能力，这样才能使选出的菌种适合保藏。其次，菌龄不宜过小或过大，否则冰箱存放后会膨胀，容易造成降解。此外，冰箱的温度应控制在2-4之间，尽量保持温度恒定，使菌丝体处于稳定的生理状态。

(2)粪便管冰箱保存法

1、保存方法：粪管培养基由100%腐熟的麦秸粉、25%的腐熟牛粪粉、8%的麸皮、1%的石膏粉、2%的碳酸钙配制而成，约含水量65%，pH7.5。配制后放入试管中，高压灭菌后，插入菌块，22-24培养。经常检查是否有污染。当草基试管菌丝长满时，及时选择生长正常、无污染的试管。用硫酸纸包好棉塞头，置于2-4冰箱中。保存方法为中期保存，一般2-3年调换一次。

2、注意事项：由于粪秸秆可以保存2-3年，如何防止粪秸秆水分流失是保存方法长短的关键。一方面，介质的含水量不能低于62%，另一方面，卫生棉条用硫酸纸包裹后，可以加一些蜡密封，防止水分渗入。蒸发。此外，如果可能，试管应存放在保湿的冷冻柜或冷冻柜中，温度控制在2-4，湿度控制在90%左右。

(3)液体石蜡保存法

液体石蜡防止培养基蒸发，将菌丝体从与空气接触的斜面分离出来，抑制菌丝体的单孢子分离，可使其休眠，延缓细胞衰老，延长菌丝体的保存时间。一般可保存5-7年。是一种中长期菌种保存方法。

1、保存方法：液体蜡保存菌种的培养基可以是PDA slant。将菌块转移至PDA斜面，22-24培养15-20天，然后用液体石蜡密封保存。液体石蜡应是化学纯的，在121C 下高压灭菌30 分钟，然后在160C 的烘箱中加热1-2 小时。高压灭菌后的液体石蜡也可置于40-60的培养箱中，使灭菌后的液体石蜡层呈乳白色直至完全透明无色。水蒸发干净。用灭菌吸管将灭菌脱水的液体石蜡放入铺满菌丝体的倾斜试管中。液体石蜡应高出斜尖约1.0cm，然后用无毒泡沫试管塞住，室温保存。

2、注意事项：菌丝培养时间不宜过短。为防止菌丝进一步发育，可适当延长菌龄或将试管放入冰箱（2-4）冷藏2天后再加入液体石蜡。倒入的液体石蜡应超过斜坡尖端约1.0 厘米。液体石蜡过低，挥发后会露出坡面，导致坡面培养基干涸，缩短保存时间。液体石蜡应烘至底部，尽量蒸发掉水分，以免棉塞因水汽蒸发而受潮发霉，影响菌种的保存。

(4)滤纸保存法

将蘑菇孢子吸附在滤纸条上，晾干后放入冰箱冷藏保存。由于保存的是有性孢子，一般不用于生产。主要起到保存种质资源和选育品系的作用。据福建蘑菇菌种研究推广站进行的滤纸孢子保鲜试验，采用该方法保存蘑菇菌种已达10年以上，孢子存活率约为50-80%。

1、保存方法：孢子采集方法同单孢子分离的孢子采集。当滤纸条上收到相当数量的孢子时，用无菌镊子将滤纸条无菌放入无菌试管中。放入真空干燥器中1-2天，除去滤纸上的水分，使其充分干燥，然后密封试管口，贴上标签，放入冰箱保存。

(5)真空冷冻干燥保存法

真空冷冻干燥简称冷冻干燥。这种方法是先用低温冷冻孢子，然后在真空条件下升华排出孢子中的水分。孢子处于休眠状态，但仍保持着原有的生命力。是一种长期保存蘑菇孢子的保鲜方法。操作如下。

(1)选用内径8mm、长120mm的中性玻璃管作为制作安瓿管的材料。将玻璃管在2%的盐酸中浸泡8-10小时，用蒸馏水清洗2-3次，放入烘箱中晾干

（２）用接种铲将收集的蘑菇孢子铲入盛有3ml无菌脱脂牛奶的试管中,稍加摇动, 制成孢子悬浮液。用无菌吸管将孢子悬浮液移入安瓿管的球形部分，每管约0.2ml,然后将管口通过火焰,用无菌镊子取少许无菌棉花塞于安瓿管口。

（３）将安瓿管放入无水乙醇与干冰混合的冻装置，温度可达-65～-70℃预冻5 分钟左右,也可在低温冰箱(-40)预冻30-60分钟。然后取出放入真空干燥器中， 用高真空活塞油封好立即抽真空，并随时用真空火花检漏仪检查真空度，发现有微小漏气处，要迅速用真空泥涂住。一般真空度应维持在10.7千帕以下,如抽真空10 分钟后仍达不到此真空度,说明真空系统不佳,可能会造成融化而失败。真空干燥器外面用1:3的盐冰水保温,其效果会好些,真空度稳定,一般抽7-8小时,可完全将安瓿瓶中水升华至干。此时应关闭缓冲瓶前的三道阀门，然后再断电。抽干后的安瓿瓶颜色应是白色，如果浅黄色或不成凹状，多数都因为真空度达不到要求而造成融化失败的结果。

（４）冻干好的安瓿瓶要进行真空熔封。可用一个顶端多歧管或一个Ｚ型管，每个分支口都接入真空橡皮管以便将安瓿管接在橡皮管内，然后抽真空，边抽真空边用煤气喷灯熔封。熔封的安瓿　瓶要进行检漏，可用高真空火花检漏仪检查。安瓿瓶内呈蓝色荧光，说明真空封口良好，也可用微带红或蓝的清水浸泡安瓿瓶，经一昼夜安瓿瓶内无颜色水浸入，则为封口合格。

（５）菌种安瓿瓶经无菌检查和存活率检查合格后，置2-8℃冰箱内保藏,一般蘑菇菌种可保藏8-10年。

（６）复苏培养时，可在开启的安瓿管内注入0.3-0.5ml的无菌生理盐水或1% 麦芽汁。菌种安瓿瓶开启时，应先将安瓿瓶的封端加热，在浸有来苏尔等消毒液的湿布上擦一下，使管壁形成裂缝，然后再轻轻敲碎。切忌猛烈割断，以免空气骤然冲入，导致污染。安瓿瓶加入生理盐水后菌种即自行溶化，摇动后即成孢子悬浮液，可接入PDA培养基上,进行萌发培养。

（六）液氮超低温保藏法

　　液氮超低温保种是把菌种装在含有冷冻保护剂的安瓿瓶内，将该安瓿瓶放入液氮(-196℃)中进行保藏,由于菌丝体处于-196℃,其代谢降低到完全停止的状态。所以不需定期移植。从理论上讲，菌丝体可以无限期地存活。蘑菇菌种的液氮保种从1970年开始进行试验,至今已有20多年的历史,经过大量的试验证明液氮保种是菌种长期保藏的最有效最可靠的方法。随着方法的不断改良，现人介绍近年来应用的一种最简便的液氮保种方法。

（１）菌种制备　菌种在PDA培养基平板上于22-24℃下培养10-15天,菌丝体充分生长后,用打孔器(直径2-4mm)打成小孔,或用接种针把菌丝培养物切成2×4mm 长方形小块。

（２）安瓿管的制备　把直径4-6mm 的聚乙烯塑料管（也可用饮料吸管）截成小段做成安瓿管。每节大约60mm长,一头用热合机封好。然后用牛皮纸包装进行121℃下高压灭菌30分钟。

（３）保护剂　10%的甘油水溶液进行121℃下高压灭菌30分钟可作为冷冻保护剂。用量为每安瓿上留有5-10mm的空间,用无菌注射器从管底注入,以防产生气泡。随后，且无菌接种针从安瓿管口放入5-8块菌种块，热合封好安瓿。 用记号笔在发瓿管外写上标签，最后在桌　上用一定的力按　压，以检查安瓿是否渗漏。

（４）液氮保藏　把已做好的安瓿菌种管放入具有孔洞的小塑料瓶中（在塑料瓶的底部放一块铁片，使塑料瓶连同安瓿管能一起沉入液氮罐中），盖好瓶盖，在瓶盖上连接一条细绳并作记号，以便提出所需的菌种。把装有安瓿管的塑料瓶吊在液氮罐口上，使安瓿管缓慢地降温，大约30分钟后,把 按瓿管浸入液氮中进行长期保存。

（５）恢复培养　如果拟取用液氮保存的菌种，可将安瓿管取出后立即放入35-40℃的温水中迅速解冻,为了防止污染,用75%酒精洗安瓿管表面,表面干燥后, 用火焰烧过的剪刀在安瓿的一端剪开,用无菌接种针把菌块移接至PDA培养基上,置22-24℃培养。