虫草液体菌种制作及质量检验方法

随着国内外市场对虫草产品需求量的不断增加，虫草的生产方式逐渐从小规模、季节性生产向工厂化、标准化、年度化、规模化生产转变。随着新技术、新工艺、新设备的发展，采用深层培养技术制备虫草液体菌种已在生产中得到应用。液体菌种具有成本低、生产周期短、菌龄一致、接种方便快捷、易于管理等优点，深受虫草栽培者的欢迎。 1、虫草液体菌种的生产方法一般可分为电磁搅拌法、摇床法、单纯深层发酵（吹氧）法、发酵罐法。 1、电磁搅拌法。设备工艺比较简单，投资少，但产量小，生产的液态菌为菌丝团。 2.摇瓶机法。摇瓶机栽培投资少，设备工艺简单，管理方便。适合一般菌种工厂生产使用。产生的液体菌株是菌球。 3、简易深层发酵（吹氧）法。生产过程繁琐，对配套设备要求高，所有部件必须在无菌条件下组装。产生的液态菌就是菌球。 4、发酵罐法。需要一套完整的发酵设备，投资大，技术要求严格。只适合大型工厂生产。产生的液态菌就是菌球。 2、虫草液体菌种的培养方法通常采用摇床法和简易深层发酵（吹氧）法生产培养液体菌种。对于小规模生产，一般可采用摇床法培养液体菌种。本文主要介绍摇瓶机振动培养技术。 1、液体培养基配方（1）马铃薯20%（煮汁）、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氢钾0.05%、硫酸镁0.05%、维生素B1 2片、水1000ml，pH值自然。 (2)马铃薯30%(煮汁)、蚕蛹粉2%、蔗糖1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、维生素B1 2粒，水1000ml，pH值自然。 (3) 20%土豆、2%葡萄糖、2%玉米粉、1%黄豆粉、0.2%酵母膏、0.15%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、1000ml水，自然pH值。 (4) 葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0.1%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、生长素5ml、水1000ml，pH值自然。 (5)葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、磷酸二氢钾0.046%、硫酸镁0.05%、磷酸氢二钾0.1%、水1000ml，pH值自然。 (6) 葡萄糖2%、蛋白胨0.4%、牛肉膏0.4%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、维生素B1 2片、水1000ml，pH自然。 (7) 葡萄糖3%，大豆粉2%，玉米粉1%，硫酸镁？ 0.05%，磷酸二氢钾0.1%，酵母粉0.5%，水1000ml，PH值自然。 (8)葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、玉米粉2%、磷酸二氢钾0.1%、硫酸镁0.05%、水1000ml，pH值自然。 (9) 葡萄糖2%、豆粉1%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.04%、氯化钠（食盐）0.03%、味精0.01%、微量维生素、水1000ml，pH值自然。 (10) 3%蔗糖、0.1%天冬酰胺、0.125%磷酸二氢钾、0.03%硫酸镁、0.05%氯化钠（食盐），1000ml水，自然pH值。 2、液体培养基的制作(1)按比例准确称取各种营养成分。 (2) 准备溶液。为避免沉淀，可将各种营养物质分别溶解制成母液。添加顺序一般是先加缓冲化合物，溶解后加主元素，再加微量元素，最后加维生素。最好在每种成分完全溶解后加入第二种营养素。如果各组分不沉淀，也可以一起加入。如果使用土豆、玉米粉、黄豆粉等原料，应先将这些原料煮成汁，再将煮汁与其他配料混合。例如：配方一液体培养基的配制。 20%土豆（煮汁）、2%葡萄糖、0.5%酵母提取物、0.05%磷酸二氢钾、0.05%硫酸镁、2片维生素B1、1000ml水，自然pH值。 (3)将新鲜土豆洗净去皮，挖出芽眼，将土豆切成小块，放入小锅或大烧杯中，加入一定量的水，文火煮约30分钟，直至土豆变软不烂，用6-8层布过滤，滤汁取入锅中。 (4) 补水。加水至1000-1200毫升。 (5)按菜谱顺序加入其他需要添加的营养素，文火煮510分钟。 (6)充分搅拌并调节pH值。一般用10% HCl或10% NaOH调节pH值，用pH试纸（或pH检测仪）检测。 (7)沉淀和包装。培养液配制好后，静置1小时，取上清液，分装于500mL锥形瓶中，每瓶体积为100mL； 750mL瓶子的体积是200mL；一个1000mL的瓶子的体积是300mL。添加0.02%植物油或0.06%消泡敌（聚环氧丙烷甘油醚）作为消泡剂，防止培养过程中培养基起泡。在每个瓶子中加入5-10 个小玻璃珠以粉碎菌丝体。 (8) 插入卫生棉条。卫生棉条弹性适中，不能太紧。加入卫生棉条后，用牛皮纸包好封口，这样既可以过滤空气，避免细菌的侵入，又可以减缓介质中水分的蒸发。 (9) 用记号笔标出培养基的名称和日期。 (10)杀菌先取出杀菌管的内层，然后在锅的外层加入适量的水，使水面与三角搁板齐平。 放回杀菌桶内，将包好的三角瓶直立放入杀菌桶内，盖上牛皮纸，三角瓶远离桶壁，防止冷凝水沾湿桶顶纸袋子并渗入卫生棉条。 加盖，将盖上的排气软管插入灭菌内桶的排气槽内。对称地同时拧紧相对的两个螺栓。 打开电加热，同时打开排气阀，使水沸腾，排除锅内冷气。待冷气完全排尽后，关闭排气阀，让锅内温度随着蒸汽压力的增加而逐渐升高，在1.0-1.1kg/cm2压力下杀菌30分钟。当锅内压力升至所需压力时，控制热源，保压所需时间。 灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌器内温度自然下降。当压力表上的压力降为0时，慢慢打开排气阀，松开螺栓，打开盖子。取出灭菌物品。如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养液由于内外压力不平衡而冲出三角瓶，造成棉塞沾染培养液而发生污染。　　三、摇瓶机振荡培养技术　　灭菌结束后，取出培养液冷却到30℃以下时，在无菌条件下接入一块约2厘米的斜面菌种，菌丝面向上悬浮于培养液液面。在20℃～22℃条件下避光静置培养48小时，再置往复式摇瓶机上振荡培养，振荡频率为80～120次/分，振幅6厘米～10厘米。如果用旋转式摇瓶机，振荡频率为200～220转／分。摇瓶机室温控制在22℃～25℃，冬季室内温度低，可将摇瓶机放入恒温箱内培养。培养时间一般是在5～7天左右。　　四、虫草液体菌种的检验方法　　虫草液体菌种进行质量检验可采用感官检查、显微镜检查、空白培养基检查和取样测验等方法。　　采用电磁搅拌法培养或摇瓶机法培养液体菌种，终止培养后，常用目测法检验，将三角瓶摇晃静止后，如菌丝球均匀地分布于三角瓶中，培养液清澈、无异味，液体中悬浮着大量均匀的小菌丝球，并伴有蛹虫草特有的香味，表示符合质量要求。　　简易深层发酵（吹氧）法或发酵罐法大量生产液体菌种，为了更好地控制培养条件，达到优质高产的目的，就需要对培养液中的污染情况、菌丝活力、菌丝体含量、菌丝球数量、PH值、总糖及还原糖、氨基酸、溶氧系数等的变化进行检测。现将有关的检测方法介绍如下。　　（一） 感官检查。可采用“看、旋、嗅”的步骤进行检查。　　看：将样品静置桌上观察。一看菌液颜色和透明度，正常发酵醪液（培养液）一般呈白色或黄褐色，清澈透明，菌丝颜色因菌种的不同或菌种见光程度而异，老化后颜色变深；染杂菌的醪液则混浊不透明。醪液变混，有两种可能性，一是细菌污染应予以淘汰；二是由于菌丝生长粘稠过大所致。若难以判断，可进行镜检。二看菌丝形态和大小，正常的菌丝大小一致，呈球状、片状、絮状，菌丝粗壮，线条分明；而染杂菌后，菌丝纤细，轮廓不清。三看上清液与沉淀的比例，菌丝体占比例越大越好，较好的液体菌种，在瓶中所占比例可达80%左右。四看pH值指标是否变色，在培养液中加入甲基红或复合指标剂，经3～5天颜色改变，说明培养液pH值到达5.0左右，为发酵点；如果在24小时内即变色，说明因杂菌快速生长而使培养液酸度剧变。五看有无酵母线，如果在培养液与空气交界处的瓶壁上有灰色条状附着物，说明为酵母菌污染所致，此称为酵母线。　　旋：手提样品瓶轻轻旋转一下，观其菌丝体的特点。醪液的粘稠度高，说明菌种性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌丝的悬浮力好，放置5分钟不沉淀，表明菌种生长力强；反之，如果菌丝极易沉淀，说明菌丝已老化或死亡。再次观其菌丝状态，大小不一，毛刺明显，表明是供氧不足；如果菌球缩小且光滑，或菌丝纤细并有自溶现象，说明污染了杂菌。