食用菌菌种质量检测技术-菌种培育技术方法-菌类种植-我要创富网

农业部根据《种子法》制定的《食用菌菌种管理办法》将于2006年6月1日起施行。该办法从菌种场的资质、生产经营到行政管理，对菌种的质量要求都有非常明确的规定。但是如何检测菌株的质量。目前检测技术尚未统一。为落实《食用菌菌种管理办法》，笔者从多年的生产实践和管理过程中总结出一套菌种质量检测技术。技术介绍如下： 1 种属检测种属是指食用菌品种特性的简称。它包括三个方面：形态特征、生物学特征和农艺性状。检测内容分为形态检测、生物学特性检测和农艺性状检测。同时，随着现代生物技术的发展。利用遗传学、同功酶和DNA指纹技术也可作为物种检测的重要手段。 1.1 形态学检测1.1.1 菌落特征观察取待测菌种（亲本种、原种或培养种，下同），用转管激活，接种于平板培养基上。在合适的温度下培养至菌落直径为培养皿直径的2/3，观察菌落形态，主要包括菌落大小、气生菌丝和厚垣孢子。同时以该品种的标准株（以下简称标准株）为对照，进行相同处理，比较两者的菌落形态。如果菌落特征存在差异。表示不同的物种；如果菌落特征没有差异。分不清是不是同一个品种。 1.1.2 拮抗试验将待测菌株和标准菌株分别进行转染和激活。在平板培养基上接种约3 个时代。在适宜的温度下培养。观察两个殖民地何时相遇。如果交界处有明显的线状特征（有的食用菌呈栅栏状，有的呈带状无菌丝），则为拮抗作用。表示要测试的菌株是与标准菌株不同的菌株：如果没有表明拮抗作用。待测菌株可能与标准菌株相同，也可能不同。无法判断。 1.1.3 菌丝显微观察在载玻片上滴一滴无菌水。待测菌株活化后用解剖针从试管中挑出少许菌丝体，置于水滴上，撕开菌丝体，盖上盖玻片。先用10倍物镜观察，再换40倍物镜观察菌丝的精细结构。特别是判断是否存在锁状关节，观察锁状关节的形态特征。测量菌丝细胞的宽度。同时。该物种的标准菌株用作对照。照着做。比较锁状连接的形态特征和两者之间的细胞宽度，如果有差异。表示不同的物种。如果两者没有区别。两者可能是也可能不是同一菌株。无法判断。 1.1.4 子实体形态特征观察待测菌种与标准菌种在相同条件下（相同培养基、同时接种、相同环境培养菌丝、同一菇房相近位置）生产。取各发育阶段的子实体，用肉眼观察菌盖、菌鳃、柄、环、花托的形态特征、大小、长度、粗细等。如有显着差异，可判定为异种。 1.2 生物学特性检测1.2.1 温度取待测活化菌株和标准菌株。分别接受相同的平板培养基（或斜面培养基）n。在适宜的温度下培养。当菌落直径为1~2cm时。在菌落边缘画一条线作为生长起始线。然后将这些培养皿（或试管）分别在5、10、15、20、25、30、35、40 和45C 下孵育。当处于生长最快温度的培养皿快要满时，在菌落边缘画一条终止线。用尺子测量起点线和终点线之间的距离。通过计算菌丝生长速率，可以得到菌丝生长温度范围和最适生长温度。如果菌丝在一定温度下不生长。然后可以将这些培养皿放置在合适的温度下进行培养。可以获得致死温度和极限生长温度（不生长不死亡）。 1.2.2 湿度取待测活性菌接种于不同含水量（如45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%）的原培养基上。在适宜的温度下培养。当菌丝覆盖并长到物料内部2-3cm时。沿着菌丝前端画一条初始生长线后，继续培养，直到瓶子快满了。再画一条终点线。用尺子测量起点线和终点线之间的距离。

计算菌丝体生长速率。可得到适合菌丝生长的含水量范围和生长的最佳含水量。 1.2.3 pH 取活化的待测菌株接种于不同pH(pH111)的平板培养基上，在适宜的温度下培养。当菌落直径为1~2cm时。在菌落边缘画一条线作为生长起始线，继续培养，待盘快满时画一条停止线。用尺子测量起点线和终点线之间的距离。计算菌丝体生长速率。可以获得适合菌丝生长的oH范围和生长的最适pH。 1.2.4光照取活化的待测菌株接种于同一平板培养基（或斜面培养基），分成2份（其中一份用黑布遮光）。置于光照培养箱中。在适宜的温度下培养。当菌落直径为1~2cm时。在菌落边缘画一条线作为生长起始线。继续培养。当盘子快满时，画一条终止线。用尺子测量起点线和终点线之间的距离。计算菌丝生长率并观察菌落特征。光对菌丝体生长的影响是已知的。 1.3 农艺性状检测将供试品系制成母种。再现为原始物种。使用适合该物种的培养基配方。做45袋袋栽（床植6m2）。接种后分为3组（每组15袋或2m2）进行常规管理。在出菇期，对每一株洪菇进行每日采收记录（重量、花数，用于分析出菇时间、产量分布、潮汐变化天数等），并根据表中所列项目进行适当的统计分析表格1 。整理测试结果。同时以该品种的标准菌株为对照，进行同样的处理。比较两者的测试结果，分析差异的统计学意义。 1.4 现代生物技术检测1.4.1 基因检测收集待测菌株和标准菌株的担孢子。通常分离单孢子以获得单孢子菌株。在物种内的单孢子菌株之间进行配对。注意锁接的形成。获得各种基因型的单孢子菌株。将待测菌株的单孢菌株与标准菌株配对。通过观察是否形成锁接。确定两个品种的不亲和因子的基因型。如果2个品种的不亲和因子基因型不同。那么就可以判断它们是两个不同的物种。如果他们的基因型相同。可能是同一物种或不同物种

种，不能确定。

　　1.4.2同工酶检测从待检菌种的菌丝体中提取的粗酶液经电泳后。进行生物化学染色。同工酶的各组分会显示在凝胶的不同位置而形成同工酶酶谱。相同的菌种遗传背景相同，其同工酶酶谱也相同。常用于品种鉴别的同工酶有：酯酶同工酶、多酚氧化酶同工酶、过氧化物酶同工酶等。

　　1.4.3 DNA指纹检测品种之间的种性差异是由于其DNA序列的差异。应用DNA检测技术判断待检菌种与标准菌种的DNA是否有差异。若有。则为两个不同的品种，若没有。则为相同品种。DNA指纹检测的方法很多。但归结起来不外乎寻找可应用于品种鉴别的特异DNA片段。即为分子标记。通过试验。检查两个品种所拥有的各种分子标记是否一样。从而作出判断。

　　2纯度检测

　　纯度指菌种的纯化（净）程度。不能混有病毒、细菌、霉菌、螨虫、线虫等。除了用肉眼观察判断外。根据染杂对象不同采用以下相应的检测方法。

　　2.1病毒检测

　　主要借鉴植物、动物病毒检测和酶联免疫法。具体做法：提纯待检菌种的病毒，用这种病毒免疫动物（如兔子），获得抗血清，应用抗原抗体结合的特异性及酶联显色技术进行检测，如果样品中存在病毒，则有颜色显现。

　　2.2细菌检测

　　取少量待检菌种。按无菌操作接入营养肉汤培养液中，25~28℃振荡培养1~2d，观察培养液是否混浊。若培养液澄清，可初步判断为无细菌污染；若培养液混浊。可初步判断为为有细菌污染。为了进一步作出准确判断。可把培养液划线接种营养肉汤平板培养基，25-28℃恒温培养1~2d.观察是否有细菌菌落出现。

　　2.3霉菌检测

　　2.3.1培养基上霉菌检测用接种针取少量待检菌种疑有霉菌污染部位。按无菌操作接种于PDA培养基中。25~28℃培养3~4d.出现白色以外色泽的菌落、非待检菌种的菌落或有异味者为霉菌污染物。必要时可用显微观察方法进行观察判断。霉菌一般是低等真菌。没有锁状联合。

　　2.3.2棉塞上霉菌检测用酒精灯把露在试管口（或瓶口）外的棉花塞烧弃。用消毒过的镊子夹出剩余的棉塞。用接种针粘取棉塞底部。转入新鲜 PDA斜面培养基。25~28℃培养3~4d后。按2.3.1方法进行判断。

　　2.4螨虫和线虫检测用接种针挑取取少许待检菌种的菌丝于载玻片上水滴中。撕散菌丝。盖上盖玻片。用lO倍或40倍物镜观察。检查是否有螨虫或线虫存在。

　　3活力检测

　　活力指菌种的生活适应能力和抗逆能力。反映菌种的活力，如菌丝形态、发菌程度、色素、分泌物、菌丝自溶、拮抗线、原基、脱壁等。这些指标都可用肉眼来判断。还可以通过以下试验来检查菌种的活力。