虫草液体菌种制作及质量检验方法（下）

虫草液体菌种生产及质量检验方法（下） 景大鹏王明辉/文章（2） 菌种显微检验方法及步骤。 1、设备显微镜、酒精灯/电炉、载玻片、接种环、雪松油、二甲苯、擦镜纸、生理盐水；结晶紫染色液，碱性品红染色液。二、操作步骤涂片——干燥——固定——染色——洗涤——显微镜检查——观察结果3、涂片。取干净载玻片，滴一小滴菌液于载玻片中央，无菌操作，充分混匀，涂成薄膜。注意菌液不要滴太多，涂抹一定要均匀。 4.干燥。在室温下自然晾干或用洒水灯/电炉烘干。 5.固定。涂片朝上，过焰2-3次使细胞质凝固，使细胞形状固定，不易脱落。但不能放在火焰上，否则细胞形状会被破坏。 6、染色。将标本水平放置，将染色液分别滴在涂膜上。染色时间的长短取决于不同的染色溶液。结晶紫染色液染色2-3分钟，酚品红染色液染色约1-2分钟。 7.用水清洗。染色时间到后，用自来水冲洗，直至洗出的水无色为止。注意冲洗水流不宜过快或过大，水从载玻片上端流下，切忌直接冲洗涂片。冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后在油浸显微镜下观察。 8、显微镜检查（1）用低倍镜观察（2）用高倍镜观察（3）用油镜观察用粗调器将镜筒抬高约2cm，转动油镜镜头到底部。 在玻片标本的镜检部位滴一滴雪松油。 从侧面看，用粗调器小心地降低镜筒，使油镜浸入杉木油中，其镜片几乎与试样接触。特别注意不要压在标本上，更不能用力过大，否则不仅会压坏载玻片，还会损坏镜片。 从目镜观察，进一步调光，使光线变亮，然后用粗调器慢慢升高镜筒，直到物像出现在视野中，再用微调器校正焦距。如果油镜已离开油面，但仍看不到物像，则必须从侧面再次观察，放下油镜，重复上述操作，直至看清物像。 观察后，将镜筒向上转动。先用擦镜纸擦掉镜头上的油污，再用擦镜纸蘸少许二甲苯（雪松油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油污，最后擦去残留的二甲苯用干净的镜头清洁纸。请勿用手或其他纸擦拭镜头，以免损坏镜头。用丝绸布清洁显微镜的金属部件。 还原各部分，反光镜垂直于镜座，将物镜转成八字形，然后向下转。同时降低聚光镜，避免物镜与聚光镜发生碰撞的危险。 9、观察结果：细菌在培养基中有明显染色（较深），呈球形、棒状。 (3)斜坡试管或空白培养基检验法。在无菌条件下，将一滴或几滴菌液吸入已灭菌的倾斜试管或空白培养基中。将盛有菌液的斜面试管或培养基置于24-32条件下培养24-48小时，观察杂菌情况。若菌丝生长旺盛呈白色，接种面无红、黄、绿、黑色菌体，则证明菌液已正常生长成熟，即可用于接种；否则说明菌液已经被细菌污染。 （四）抽样试验1、菌丝活力检测用显微镜观察虫草菌丝的边缘，以及菌丝的粗细和分枝情况。培养液静置几分钟，无菌泥沉下，说明它有很强的生命力。 2、菌丝体含量的测定取发酵液不少于100ml，用水洗涤至水相澄清，置于装有已知干重滤纸的砂芯漏斗上于60真空过滤，然后将菌丝连同滤纸一起在60 下风干2小时，快速称量，精确至0.01 g。菌丝干重（g/100ml）={菌丝干重（g）100}/发酵液取样体积（ml） 三、菌丝球数量及大小的测定（1）菌丝球数量的测定不少于取发酵液50毫升以上，在带塞量筒中按一定比例加水稀释，摇匀，取一定量均匀铺于直径150毫米的培养皿中，底下垫方格纸培养皿，用网格法计数。菌球数（个/100ml）={菌球数（个）100}/相当于发酵液体积（ml）。

发酵结束时菌丝球浓度为每毫升1000-1500个。 (2)菌丝球大小的测定。取30多个菌球在培养皿中排成一排，测量总长度，精度为1毫米。菌球平均直径（mm/个）=菌球总长度（mm）/菌球数（个） 发酵液中只有一定比例菌球的，按体积或重量百分比计算，然后测量它的大小和数量；球体为球形或类球形，直径大于1毫米，肉眼可见。 4、pH值的测定。使用pH 检测器或酸度计进行测量。发酵结束时的pH值降至5.5。总糖和还原糖的测定。采用改良培林法测定。 6、氨基酸氮的测定。甲醛法测定。 7、体积溶解氧系数的测定。用亚硫酸盐氧化法测定。液体菌种配制后，应立即使用，不宜久存。如暂时不用，可在室温（15-30）下保存2-3天，最长不超过7天。贮藏时间过长，菌种容易老化或变质。如果要保存菌种，可以用冰箱低温保存，在4环境下36个月后仍能繁殖。通过对液体菌种质量的检测，可以在早期及时、准确地判断液体菌种的培养状况，避免盲目大量接种培养，从而避免不必要的经济损失，起到一定的促进作用。保证液体菌种的生产和应用。 （完） 主要参考文献： [1] 李浩虫草人工栽培及深化开发。科技文献出版社，2003 [2]潘学仁食用菌栽培。哈尔滨出版社，19953王维云，朱锦华；食用菌液体深层发酵

　　［4］卢翠文。 北冬虫夏草液体培养条件的优化与诱变育种[D]广西师范大学， 2007 .

　　［5］康源春； 食用菌液体菌种的制作与应用 [N];河南科技报； 2004年。

　　［6］张翠霞，孟庆国，冯华，陈丽媛，孟宪志，李莉； 食用菌液体菌种在生产和使用中应注意的问题 [J];中国食用菌； 2004年04期； 50-51.