灵芝菌种的分离技术

灵芝菌株的分离方法有组织分离法、孢子分离法和基质内菌丝分离法。这三种分离方法各有特点：分离基质中的菌丝，因易污染，较少采用；孢子分离，又称有性繁殖，一般用于菌株的研究和复壮；一般来说，组织分离常用于大规模生产。操作简单，可保持原菌株的优良性状。一、子实体组织分离法

选择形态发育正常，无病虫害，无灵芝孢子喷出，菌盖边缘尚有黄白色子实体生长的灵芝子实体。它们具有很强的再生能力和维持亲本物种的能力，属于无性繁殖的范畴。组织分离应用广泛，操作简单，容易成功，是分离纯灵芝菌种的简便方法。

1、幼芽分离将灵芝菌柄尖部膨大的幼芽剪下，在无菌条件下用75%的酒精棉球擦拭干净，然后用烧焦的刀片从柄部浅划一刀，将其折断两半，用锋利的接种刀在幼芽中挑取切下一小块菌肉，移栽到坡中央，28阴凉处培养。如果菌丝长满坡面，就是母种。

2、菌盖分离选择生长正常、健壮和未成熟子实体的子实体，剪去菌柄，用75%酒精棉球擦拭菌盖正反面，然后在黄白色生长圈处剪去外皮在菌盖壳的边缘，掰下一片嫩菇菌盖，用烧过的手术刀在横截面上纵横切成米粒大小的组织片，放入无菌培养皿中，最后转移28避光培养，用接种刀将组织切片至斜面。整个操作需要在严格的无菌条件下进行。

未形成灵芝菌盖的幼灵芝菌柄也可作为分离材料。

2、灵芝孢子分离法

孢子分离法是从灵芝子实体中采集成熟的有性担子孢子，经培养萌发成纯菌丝的方法。孢子分离出的菌丝体龄短，生命力强，有性孢子具有双亲的遗传特性，是培育新品系和杂交育种的材料。但孢子分离污染率较高，及时清理污染试管。

1. 孢子采集以赤芝为例，选取孢子帽红褐色、有光泽、成熟、无白色生长圈的典型个体。瓶（袋）上可见少量散落的孢子粉，大小适中，无病虫害。固体，剪去菌柄，用棉球蘸取0.1%氯化汞溶液，反复擦拭瓶盖正反面，孔侧要光亮，然后用无菌水充分冲洗，用无菌纱布。孢子采集有以下几种方法：

、弹射法在无菌条件下，用烧过后的粗注射针在剪去灵芝茎部的地方钻一个小孔，插入培养皿的金属丝架上，将培养皿放好在铺有纱布的搪瓷盆中，盖上钟罩或无底蘑菇瓶，在28-30、相对湿度90%的条件下培养。当培养皿内有大量褐芝孢子粉落入时，取下钟罩和支架，盖上培养皿，用透明胶带密封或用无菌纸包好备用。所有使用的设备必须事先用纸包好并进行无菌操作。

.贴壁法将1cm厚的PDA培养基置于锥形瓶（即锥形瓶）中，加棉塞灭菌，冷却成平板。无菌条件下，将无柄子实体表面按上述方法消毒，放在无菌纸上，沿菌管方向剪几小块，拔出锥形瓶塞，取出子实体小块身体在棉塞底部蘸上胶水，然后放回锥形瓶口。 28-30培养，如见棕色孢子落在培养基表面，可在无菌条件下除去棉塞上的菌团。

贴附方法也可以贴在试管斜面正上方的管壁上。如果菌盖较厚，可切去部分壳和果肉，等孢子散落在斜坡上时，将菌块去掉。

2、菌丝体在无菌条件下培养。将喷射法采集的孢子用接种环蘸少许在斜坡上抖落，或将少许孢子放入试管中的无菌水中（用20%的灵芝子实体煮汁）更理想)制成孢子悬液，然后平铺于斜坡或平板上，28-30培养。平板或斜坡上附着法得到的孢子可直接在合适的温度下培养1周左右。孢子发芽后，挑出发芽早、生长旺盛的菌落，移栽到新坡上。修炼之后，就会变成雌性。种类。

在田间分离灵芝孢子时，由于条件所限，可将菌肉（携带管）粘贴在试管壁上，孢子弹注入培养基后及时转管。

孢子萌发后，先形成初级菌丝，数日后可形成次级菌丝。如果在显微镜下观察到锁节，一般可以确定已经获得了灵芝菌丝。

孢子分离得到的品系变异性大，不宜直接用于大规模生产，而应选择具有该品种优良性状的后代进行组织分离，再用于生产。

3. 基质内菌丝分离法

基质内菌丝分离法是以灵芝的生长基质为分离材料，获得灵芝菌种的方法，也属于无性繁殖的范畴。优点是当灵芝子实体老了时，仍可得到灵芝的纯菌丝体。

基地菌丝分离法很少用于灵芝，因为灵芝子实体生长时间长，一年四季春夏秋三季均有发生。该材料比其他食用菌更易获得，子实体保存时间长。只有在灵芝资源调查，或选择野生种进行驯化时，当灵芝子实体已释放孢子并成熟时，才不能用于孢子分离和组织分离。

分离灵芝木基菌丝的方法是选择枯木或有灵芝子实体且无裂叶菌及其他多孔菌生长的树根，用普通水冲洗，去除泥沙和杂质。摘下灵芝子实体，从最老的子实体两边锯掉，如果灵芝（根）较粗，用刀劈成几片。在无菌条件下，用75%酒精擦拭消毒，将手柄根部置于酒精灯火焰上灼烧，并用手术刀切开表皮，每切一次灼烧一次，以防交叉-感染。然后将带有白色菌丝的切面上的细小木屑或颗粒剪刮下来，用接种铲转移到PDA坡中央，28阴凉处培养。如果白灵芝菌丝长出并覆盖在管子上，就是母体。

分离时接种物应尽可能小。分离出的菌株只有通过结果试验确认为优良菌株，才能用于生产。

其他品种也可借鉴此法。