食用菌菌种保藏方法大全

菌种是我国重要的生物资源。针对自身的遗传性和变异性，如何在菌种保藏过程中降低菌种衰退和死亡的速度，防止杂菌污染，保持菌种遗传性状不发生突变，使菌种优质高产菌种在生产中的应用由来已久，已成为食用菌领域的重要课题。为了满足大批量生产的需要，为了满足大批量生产的需要，本文介绍几种简单实用的菌种保藏方法。

1 菌株保藏的基本原则

通过低温、干燥、缺氧和饥饿等手段使菌丝体的生理代谢减到最少。首先，要选择优质的纯菌种，包括菌丝体及其孢子；其次，根据其生理生化特点，人为创造低温、干燥或缺氧等条件，抑制微生物的新陈代谢，使其生命活动极度降低。低水平或处于休眠状态，从而延长菌株的寿命，保持菌株原有的性状，防止突变。

2 菌种保存方法

2.1 菌种在试管斜面上的保存方法

2.1.1 低温定期移植保存方法

将需要保鲜的菌种接种于适宜的斜面培养基上，在适宜的温度下培养，待菌丝在斜面上长势旺盛时取出，置于3~5或低温干燥处保存4C 的冰箱。移植、转管每6个月一次，应根据菌株特性而定。存放时应注意环境湿度不宜过高，以免霉菌通过棉塞进入管内。因此，如果使用卫生棉条，可以将卫生棉条用干净的塑料薄膜或牛皮纸包裹起来，也可以使用经过消毒的白色橡胶塞，并用石蜡密封，以减少污染的机会，防止介质变干。除草菇外，大部分食用菌菌种均可采用此法保鲜。

2.1.2 液体石蜡保存法

取化学纯的液体石蜡放入高压灭菌的锥形瓶中，放入40培养箱中，蒸发掉其中的水分，直至石蜡油完全透明。将处理好的石蜡油转移到空白斜坡上，28-30培养2-3天，证明无杂菌生长即可使用。然后将母种接在斜面培养基上，待菌丝斜面长得肥大时，斜面注入液体石蜡，注入量应比斜面高1cm，使菌体与空气隔绝，减少新陈代谢容量。管口用灭菌后的白色橡皮塞塞紧，石蜡密封，直立于室内或冰箱干燥处保存。一般可存放1年以上，低温下可延长存放时间。使用时，从斜坡上挑取少许菌丝体，转移到斜坡上新鲜的培养基中培养。因菌丝被液体石蜡沾染，生长受到影响，需再次移栽，恢复正常生长。

2.1.3 白色胶塞密封贮藏方法

选择与试管口径相匹配的白色橡胶塞，用0.2%的克里酚皂液清洗，用酒精浸泡备用。当试管斜面布满菌丝时，在无菌条件下拔出棉塞，取浸湿的白色橡胶塞，隔着火焰迅速插入试管口，石蜡封口。这种方法可以达到类似于石蜡油储存的效果。用此法保存的菌种可存活13年，但以每年移植一次为宜。

2.1.4 蒸馏水保存法

将8株成熟的试管菌株置于接种箱内，注入蒸馏水，浸入培养基斜坡至距管口2cm处。管口用白色橡皮塞塞紧，石蜡封口，室温阴凉处直立保存约1年。

2.2 无坡固菌系列保鲜法

2.2.1 麦麸保鲜法

将麦麸与水按0.80：1的比例充分混合后，放入试管中进行高压灭菌，无菌检验合格后接种，在适宜的温度下培养至菌丝发育良好，然后放入将试管放入真空干燥器中。用真空泵抽干麦麸培养基中的水分，然后移入盛有硅胶的干燥器中，用凡士林密封，室温保存35年。

2.2.2 粮食保鲜法

取优质小麦，洗净浸入20水中5小时，捞出稍干，放入试管中，占管深的1/3，高压灭菌后灭菌并趁热摇匀，冷却后加入菌丝体，在适宜温度下培养菌丝布满基质后，用石蜡密封棉塞，冷藏或20以下干燥处保存，可保存1至2年。

2.2.3 木屑保存方法

混合78%的阔叶木片、20%的麦麸、1%的蔗糖和1%的石膏粉。混合后加水拌匀。 2/3的试管用石蜡棉塞密封，低温或常温保存，一般可保存12年。

2.2.4 稻草粉保鲜草菇菌种

草菇斜面菌种在2-4条件下存放2天会失去活力，常温保存时斜面培养基会迅速脱水，影响菌种的存活。用草粉保鲜草菇菌种有其独特的优点。其配方为稻草粉75%、麦麸22%、石膏粉1%、碳酸钙1%、蔗糖1%，加水适量调匀调湿。放入试管中，按常规接种培养高压灭菌。当菌丝长到试管的2/3时，用石蜡密封试管口的棉塞。常温保存至次年，不影响其活力和种子品质。

2.3 液体系列菌种保存方法

2.3.1 生理盐水保存法

将待保藏菌种放入马铃薯培养液中，将60mL培养液置于250mL三角瓶中，每天摇动或摇动5-10次，培养5-7天，然后用吸管吸入形成的菌丝球无菌移液管将4-5个菌丝球放入每管盛有5mL无菌生理盐水，用无菌白色橡皮塞塞住，石蜡密封，低温保存1-2年。

2.3.2 营养液保存法

营养液的配方为马铃薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸镁0.15%、少量硫酸铵。每支试管装满5mL。灭菌后，用无菌移液管吸取4-5个深层生理盐水保存法培养的菌丝球于试管中，10-25室温保存。它们可以存活2-3 年。效果优于生理盐水保存法。菌株形成子实体的能力不受影响。

2.3.3 无菌水保存法

将培养好的斜面菌切成小块，与培养基一起转移到盛有适量无菌蒸馏水的试管中，用白色橡皮塞密封，室温20左右保存.可存活12年。磷酸盐缓冲液也可用作保存液，缓冲液的pH值取决于各保存菌株生长的pH值。该方法简单易行。

　　2.4 利用孢子保存菌种系列方法

　　2.4.1 滤纸片保藏法

　　取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）滤纸，剪成4.0cm×0.8cm的小纸条，平铺在培养皿中用纸包裹进行灭菌。采用钩悬法收集孢子，让孢子落在滤纸条上。将载有孢子的滤纸条放入保藏试管中，白胶塞封口，再将保藏试管放入干燥器中1～2d，除去滤纸水分，然后低温保藏。保存期可达２～10年。

　　2.4.2 沙土管保藏法

　　取河沙用水浸泡洗涤数次，过60目筛除去粗粒，加用1％稀盐酸煮沸30min，以除去其中的有机质，再用水冲洗至pH值达到中性，烘干备用。同时取非耕作层的瘦黄土或红土，用水反复冲洗至中性，烘干碾细，过100目筛，将处理好的沙与土以2～4∶1混匀，然后分装小试管内，每管装0.5g，高压灭菌（1.5kg/cm2）3次，再干热灭菌（160℃，2h）1次，待无菌检验合格后方可使用。将已形成孢子的斜面菌种，在无菌条件下注入无菌水3mL，刮菌苔，制成菌悬液，再用无菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土为止。将接种后的沙土管放入盛有干燥剂的真空干燥器内，接上真空泵抽气至沙土干燥为止。真空干燥操作需在孢子接入后48h内完成，以免孢子发芽。制备好的沙土管石蜡封口，在低温下可保藏2～10年。

　　此外，还有甘油保藏法、枝条保藏法、超低温液氮保藏法、冷冻真空干燥法等。菌种保藏方法虽多，但也各有利弊。其中低温定期移植保藏法虽然简单易行，不需特殊设备，但需几个月转管1次，转管的次数多了，变异的可能性就增大，易造成菌种衰退。

　　近年来人们找到一种目前认为最有效广谱安全的保藏方法——超低温液氮保藏法，ATCC 用这种方法保藏双孢蘑菇，9年后菌种仍保持稳定，是目前国际上公认为较为理想的菌种保藏方法。但需要液氮保藏罐设备，且液氮来源有限，费用高，只有少数科研院所使用，无法推广。此外，还有冷冻真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本较高。

　　3 菌种保藏效果的鉴定

　　常用指标是菌株的存活率和接种物成活率。为确切判断菌株在保藏后是否发生变异，还须从以下4个方面进行观察和测定：①生物学特征，如菌丝形态、颜色等；②对基质分解能力，如走菌、吃料速度等；③遗传特征，如相关酶的酶谱、酶活力等；④生产出菇能力，包括产量、质量。通过经常检验，以确保不出现任何退化迹象的菌株取得菇农的信赖。通过保藏菌种的效果鉴定，可以对保藏方法加以改善，使保藏体系更加完善。（来源：河北省食用菌产业技术创新联盟）