姬松茸液体菌种制备初探

通过正交试验筛选出适合于姬松茸液态菌培养的合成培养基（20.0% N?6I、30.0% N?6II、5.0%蔗糖、0.3%酵母粉），以及第一阶段摇动菌丝体生物量瓶种和二级摇瓶种分别为1.480.06 g/100 mL和2.640.05 g/100 mL。栽培实验表明，液体菌种的发芽时间比固体菌种短13天。姬松茸；N?6培养基；摇瓶培养；液体菌株S646.150.4A，木犀科，姬松茸属，是一种具有广阔发展前景的食用菌和药用菌。其子实体含有多糖、核酸、甾醇等生物活性物质，以及人体必需的多种氨基酸。经常食用可降低血压和胆固醇，对肿瘤、痔疮、神经痛等有一定疗效[1]。我国于1990年代初从日本引进姬松茸菌株。近年来在福建、四川、湖北等地已有一定规模栽培。大多数用于生产的品种是大麦品种。 1997年以来，对姬松茸深层发酵的研究较多[2-7]。但在姬松茸液体菌种制作过程中，往往一级摇瓶种子生物量低，二级摇瓶种子菌丝体低。接种固体培养基存在球数少、生长速度慢、菌丝球大、发芽慢、生长无优势等问题，制约了姬松茸液体菌在实际生产中的应用。因此，我们在前人对姬松茸发酵研究的基础上，探索姬松茸液体菌种的生产工艺，以满足工厂化种子生产和栽培的需要。 1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试验菌株姬松茸ABM-3管保藏菌种均引自华中农业大学菌种实验中心。 1.1.2 母种活化培养基PDA培养基：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L； 富含麸皮的PDA培养基：100克麸皮煮沸30分钟，提取，取汁加入PDA中； 含盐PDA培养基：加MgSO?47H2O 0.5 g/L，CaCl?20.1 g/L，KH2PO?41.0 g/L，FeSO?4 0.1 g/L， 4）？ 2SO ? 43.0 克/升。 pH均为7.0。 1.1.3 N?6原液根据植物组织培养N?6培养基配方[8]，分别配制无机常量元素原液N?6I和有机成分原液N?6II。 N?6I储备液的组成为：KNO?3 28300 mg/L, (NH?4)?2SO?4 4630 mg/L, CaCl22H2O 1660 mg/L, MgSO?47H2O 1850 mg/L, KH2PO4 4000 毫克/升； N?6原液成分为：烟酸50 mg/L、VB?6 50 mg/L、VB?1 100 mg/L、甘氨酸200 mg/L。 1.1.4原种及栽培堆肥原种及栽培堆肥配方为：84%发酵棉籽壳、10%麸皮、5%发酵牛粪粉、1%石膏、1%碳酸钙、pH 7.0、水含量为65%。 1.2 方法1.2.1 母种活化培养取保藏种于ABM-3试管中，分别接3种母种活化培养基，每管插1株0.50.5cm菌株，处理每个处理10个试管。 25恒温培养箱避光培养，观察菌丝发芽时间、满管天数和菌丝生长势。从而筛选出合适的母种激活培养基，选用优选的ABM-3试管种作为试验母种。 1.2.2 ABM-3菌液的制备1.2.2.1?液体合成培养基筛选初级摇瓶种子的制备将激活15天的ABM-3试管种子放入培养液[2%蔗糖、1%大豆粉%、玉米粉2%、酵母粉0.2% , (NH?4)?2SO?4 0.1%, MgSO?4?7H2O 0.05%, CaCO?3 0.1%],每瓶装0.50.5 cm菌丝四片，25静置培养48 h,然后在150 rpm 的恒温振荡器上培养8 天。 1.2.2.2？液体合成培养基的筛选选择了N?6I、N?6II、蔗糖和酵母粉4个因子，设计了L?9(34)正交试验。测试因素和水平见表1。每个处理重复4 次，分装于250 mL 锥形瓶中，每瓶50 mL，用8 层纱布密封，121 灭菌35 min。插入5 mL 准备好的ABM-3 主摇瓶种子，并在25C 和150 rpm 的摇瓶中培养5 天。 干燥至恒重，称取菌丝干重。并据此评价筛选出适用于ABM-3的液体合成培养基。

1.2.2.3？液体静态培养准备正交试验筛选的液体合成培养基，装入250 mL锥形瓶中，每瓶50 mL，共2瓶，每瓶放入磁力搅拌器，灭菌后，4片（0.5 0.5 cm)的活化ABM-3试管置于每瓶中，25暗室静置培养5天后，将锥形瓶置于磁力搅拌器上搅拌12小时，得到菌体菌丝碎片的解决方案。 1.2.3 摇瓶培养将液体静态培养得到的菌液按接种量的10%，置入经筛选的液体合成培养基（250 mL锥形瓶，50 mL容量）中，25 ，150 rpm摇瓶培养5天，准备10瓶一级摇瓶；根据蔡德华等人的公式。 190 rpm 5天， 得到10瓶二次摇瓶。随机取样三瓶，测定一级摇瓶种和二级摇瓶种的菌丝体生物量。 1.2.4 栽培试验堆肥装入1736 cm 聚乙烯指节袋中，填充高度12 cm，121灭菌2.5 h。将二级摇瓶接种到培养袋的培养料中，每袋接种菌液10 mL。将原种子置于装填高度为3cm的250mL锥形瓶中，25培养15天。将固体原始种子插入同一个栽培袋的堆肥中

　　2 结果与分析 　　 　　2.1母种活化培养试验结果 　　姬松茸菌丝在不同活化培养基上的生长见表2。①号培养基上菌丝稀疏；②号培养基上，菌丝茂密，先端整齐，气生菌丝发达；③号培养基上菌丝萌发快，但后期菌丝与①号培养基上的菌丝生长势相当，明显差于②号培养基上的菌丝，这可能是培养基中的小分子无机营养成分能更快地被姬松茸利用所致。由此可知，麸皮加富PDA培养基是适宜于ABM-3母种活化和扩繁的培养基。 　　2.2液体合成培养基正交试验结果 　　N?6培养基提供N源、矿质元素及生物因子，蔗糖和酵母粉提供C源、N源，进行L?9（34）正交试验，测定菌丝体干重。由表3可知，7号组合的菌丝体干重最高，达到0.85 g/100 mL,极差表明，各因子的最优组合是A?2B?3C?3D?2，即N?6Ⅰ20.0%，N?6 Ⅱ 30.0%，蔗糖5.0%，酵母粉0.3%。 　　 　　由R值的比较得出A＞C＞B＞D可知，四因素中N?6Ⅰ对菌丝体生物量的影响最大，而酵母粉的影响最小。这与贾薇等 ［9](2002)的报道相一致。 　　2.3液体静置培养 　　姬松茸菌丝在液体合成培养基上静置培养过程中，无论是在液面，还是在液内菌丝均能蔓延生长，培养5 d可形成松散的菌絮。将培养的锥形瓶置于磁力搅拌器上，转动的磁力搅拌子将菌絮打散，经过12 h即可获得含有大量菌丝片断的菌液。 　　本文原文　　2.4一级摇瓶种子 　　在制备用于液体合成培养基筛选的一级摇瓶种的过程中观察到：原试管种小块很快结块成团，很难得到分散的菌丝球；培养6 d后，菌丝开始挂附于瓶壁，继续培养2～3 d才可见培养液中有较为均匀的菌丝球，但数量较少，整个培养周期为9～12 d。而用液体静置培养后的菌液转入一级摇瓶培养，5 d后即可见菌丝挂壁，合成培养基醪液中含有大量直径约2～3 mm的白色菌丝球,其菌丝体生物量为1.48±0.06 g/100 mL。但随培养时间的延长，菌丝球的颜色逐渐由白变棕、由棕而黑，失去活力。故宜选用培养5 d左右的一级摇瓶种子转接二级摇瓶培养。 　　2.5二级摇瓶种子 　　二级摇瓶培养5 d，菌丝体生物量可达2.64±0.05 g/100 mL,菌液内充满菌丝球，直径约2～3 mm,大小均匀，是非常适合于生产用的液体菌种。 　　2.6栽培试验 　　采用液体菌种接种袋装栽培培养料，菌丝一般20～22 d满袋；而用固体原种（对照）接种相同培养料，菌丝32～35 d才满袋。液体菌种发菌比对照缩短13 d。 　　 　　3 小结 　　 　　3.1?试验表明，麸皮加富PDA培养基是适宜于ABM-3母种活化和扩繁的培养基。正交试验筛选出适宜培养姬松茸菌液的液体合成培养基配方为：N?6Ⅰ20.0%，N?6 Ⅱ30.0%，蔗糖5.0%，酵母粉0.3%，以此液体培养基制备一级摇瓶种和二级摇瓶种，其菌丝体生物量分别为1.48±0.06 g/100 mL和2.64±0.05 g/100 mL。栽培试验表明，液体菌种在培养料上发菌快，可缩短生产周期。 　　3.2?本试验采用由静置培养到摇瓶培养、由合成培养基到天然培养基的工艺制作姬松茸液体菌种，并提出姬松茸液体菌种制作的工艺为：母种活化→液体静置培养→一级摇瓶培养→二级摇瓶培养。对于大规模生产液体菌种，还有待进一步研究。