野生桑黄菌种分离与培养特性研究初报

桑黄属Basidiomycotina，Hymenomycetes，Aphyllophorales，Hymenochaeyaceae，Phellinus，是一种真菌(P. igniarius)，P. baumii和P. linteus的通用名(商品名)，生长于杨、桑、柳等阔叶树上，桦树、山毛榉和桃树枯死的直立树木、直立树木和树干[1]。桑黄初看起来像一块黄土，经过一段时间的生长，它看起来像从树桩上伸出的舌头[2]。子实体多年生，侧向无梗，坚硬木质，蹄形，扁半球形或不规则形，覆盖面浅肝褐色至灰褐色或黑色，初有细毛，老时常有明显的纵横裂纹，具同心环棱，钝边，黄色翻边，果肉蛋黄色或淡褐色，木质，菌管多层，层次不明显[3]。桑黄因其寄生树种不同，其形状、颜色和成分也各不相同。目前市场上销售的桑黄有桑黄、桑黄松、桑杨、桑黄等，其中以桑黄最好，价格也最高。桑黄是一种珍贵的药用真菌[3-5] ，被誉为“森林黄金”。《中药大辞典》记载其子实体可入药治疗崩漏、血淋、带下、经闭等妇科疾病[6]，其抗菌、抗癌、抗纤维化、抗氧化作用也十分显着，因此具有成为国际研究领域的研究热点，我国尤其是日本和韩国对其进行了广泛而深入的研究。由于桑黄价格高，供不应求，必然导致桑黄采集无序，加之桑黄自身生理生态的特殊性和复杂性，以及外界条件的制约，桑黄子实体的形成自然界中非常稀缺，使得天然桑黄资源稀缺，面临枯竭。由于桑黄的生长周期相当长，需要20-30年才能长成适合药用的大小，因此人工栽培非常重要。本文拟分离野生桑黄纯种并研究其栽培特性，以期实现桑黄的人工栽培和商品化，同时也为桑黄发酵制品的生产及其制剂做一些基础工作。 1 材料与方法1.1 材料1.1.1 桑黄子实体采自陕西省宁陕县自然保护区海拔约1800 m的枯死白桦树。选择未木质化、无破损的子实体，用纸包好带回实验室。 1.1.2 富含PDA培养基的分离培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO3 1 g，MgSO4 0.5 g，维生素B4 110 mg，琼脂20 g，蒸馏液1000 mL水，pH值自然。 1.2.3 碳源测定基础培养基：蛋白胨5g，KH2PO41g，MgSO? 40.5克，维生素B？ 110 mg，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 值自然。 1.2.4 氮源的测定基础培养基葡萄糖20 g，KH2PO41 g，MgSO? 40.5克，维生素B？ 110 mg，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 值自然。 1.1.5 栽培培养基桑木屑培养基：100%桑木屑，含水量60%62%。将新鲜无杂质的桑葚锯末按水的比例加入，搅拌均匀至用手轻轻揉成一团，手指间有水但不流动，一触即散，放入500 mL广口瓶，每瓶150 g。瓶口用两层棉纸和一层防潮塑料扎好，0.1MPa灭菌2h。新鲜桑枝木段培养基：取直径3~5厘米的新鲜桑枝，锯成4厘米长的木段，每段一分为二，装入广口瓶（瓶口直径7.5厘米，高12 cm），12元一瓶，瓶口还绑了两层棉纸和一层防潮塑料，0.1MPa消毒2小时。 1.2 方法1.2.1 桑黄子实体处理取新鲜的桑黄子实体，用干净的毛刷除去菇体表面的杂质，用75%酒精擦洗外表面固体5次消毒，然后放将其放入无菌烧杯中以备后用。 1.2.2 桑黄组织分离法将处理好灭菌后的子实体撕开放在超净工作台上，用灭菌手术刀在菌片中央切出一块米粒大小的组织，放在菌片上无菌培养板将培养皿表面倒置，置于25培养箱中培养。

待菌丝长出后，取生长快、菌丝长的菌丝块，转移到另一无菌平皿表面培养。转移到斜面培养基表面，25培养12天，菌丝遍布斜面，无菌，为黄黄母种。 1.3 野生桑黄人工培养条件研究1.3.1 温度实验选用富集的PDA 培养基为基础培养基，设置13、18、23、28、33 和38 6 个温度处理，每个处理重复5次。第二次评价。将从组织中分离的桑黄真菌插入并培养6天。以平板培养基上菌丝体的生长速度作为菌丝体生长指标，取平均值比较不同温度对桑黄菌丝体生长的影响（接种块萌发速度和菌丝体生长速度均影响因此，在菌株发芽后长约1cm时画起点线，在培养皿快满时画终点线，两条线之间的距离除以天数，即为生长. 速度cm/d, 下同)。 1.3.2 pH测试选用富集的PDA培养基作为基础培养基，分别用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl调节培养基的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0和7.5。 每个处理重复5 次。接种桑黄，28培养6天。以菌丝在平板培养基上的生长速度作为菌丝生长的指标，取平均值比较不同pH值对桑黄菌丝生长的影响。 1.3.3 碳源试验碳源测定基础培养基5份，分别加入2%蔗糖和2%可溶性淀粉

　　1.3.4　氮源试验

　　氮源测定基础培养基5份，分别添加0.5%的蛋白胨、0.5%的（NH?4）?2SO?4、0.5%的NH?4NO?3、0.5%的牛肉浸膏和0.5%的酵母膏。每个培养皿内分别加入20 mL培养基，每组由5个平板组成。将桑黄菌种接入制备好的平板中，28 ℃培养6 d，以平板培养基上菌丝生长速度作为菌丝生长量指标。实验重复5次，取其平均值，比较不同氮源对桑黄菌丝生长的影响。

　　1.3.5　桑树锯木屑和鲜桑树枝木段培养基栽培试验

　　将桑黄母种分别接种在桑树锯木屑培养基内或鲜桑树枝木段条块表面，28 ℃培养45 d，每天记录桑黄菌丝生长情况, 测定不同栽培培养基对桑黄菌丝生长的影响。

　　2　结果与讨论

　　2.1　野生桑黄的培养特性

　　2.1.1　菌丝生长特性

　　菌丝生长慢，2周内覆盖平板。生长新区锯齿状，白色，轻微升起的气生菌丝延伸到生长区的边缘。菌落白色至微带奶油色、黄褐色、蜜黄色。边缘绒毛状，较老的部位为棉花状和羊毛状、毡状。生长新区反面无变化，老区反面奶油黄色到黄褐色。

　　2.1.2　菌丝特征

　　生长新区的菌丝薄壁，透明，有一主干，呈树枝状分枝，具不明显的简单分隔，直径3.0~6.0 μm。气生菌丝如生长新区的菌丝，纤维菌丝或多或少具加厚的壁，微绿色至黄色到褐色，稀少分枝，不分隔，直径1.0~3.0 μm，菌丝上具连续的不规则膨大的表皮细胞，念珠状，薄壁，偶尔呈直角分枝，内含物丰富，直径5.0~7.0 μm。基内生菌丝如生长新区的菌丝。

　　2.2　野生桑黄菌人工培养条件研究结果

　　2.2.1　温度对桑黄菌丝生长的影响

　　桑黄菌丝对温度的变化很敏感，菌丝生长速度随温度的升高而加快，28 ℃时最快，随后又逐渐降低（表1）。从表1可以看到，桑黄菌丝在13~38 ℃的范围内均能生长，最适生长温度为28 ℃。

表1 不同温度对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱

表2 不同pH对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱

　　表3 不同碳源对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱

　　2.2.2　pH 对桑黄菌丝生长的影响

　　不同pH对桑黄菌丝生长的影响见表2。从表2可以看到，桑黄菌丝在pH5.5~7.5的范围内均能生长，最佳pH是6.5。

　　2.2.3　碳源对桑黄菌丝生长的影响

　　不同碳源对桑黄菌丝生长的影响见表3。从表3可以看到，桑黄菌丝在供试的5种培养基上均可生长，但在添加葡萄糖的母种培养基上菌丝浓密健壮，生长势旺盛；在添加麦芽糖的母种培养基上生长势最弱。因此，桑黄菌丝生长的最佳碳源是葡萄糖。

　　2.2.4　氮源对桑黄菌丝生长的影响

　　不同氮源对桑黄菌丝生长的影响见表4。从表4可以看到，桑黄在供试的5种氮源培养基上均可生长，但在以蛋白胨为氮源的培养基上菌丝生长速度最快，且菌丝浓密健壮，生长势旺盛；在以酵母膏为氮源的培养基上菌丝生长势最弱。因此，桑黄菌丝生长的最适氮源是蛋白胨。

　　2.2.5　桑树锯木屑和鲜桑树枝木段对桑黄菌丝生长的影响

　　桑黄菌丝在两种不同培养基上的生长见表5。从表5可以看到, 在鲜桑树枝木段培养基上桑黄菌丝生长良好，虽然菌丝长满瓶时间较晚, 但菌蕾出现早(菌蕾初期如拇指大小，扁半球形或马蹄形，1.5×3.0 cm，厚0.5~1.0 cm，浅肝褐色至暗灰色，有同心环棱，边缘钝)；在桑树锯木屑培养基上桑黄菌丝生长速度快，菌丝满瓶早，但菌蕾出现晚。由此可见, 鲜桑树枝木段是桑黄菌丝人工栽培的最佳培养基。

表4 不同氮源对桑黄菌丝生长的影响

　　1）表中数据为5次重复的平均值　　2）“+++”表示菌丝生长势强，“++”表示菌丝生长势一般，“+”表示菌丝生长势弱

表5 不同栽培培养基对桑黄菌丝生长的影响

　　3 讨论

　　3.1?试验结果表明，桑黄菌丝生长的最适温度为28 ℃；最适pH为6.5；最适碳源是葡萄糖；最适氮源是蛋白胨；最适栽培培养基为鲜桑树枝木段培养基。本研究为桑黄菌种生产、菌丝体发酵及子实体人工栽培培养基配方和条件的确定提供了参考。

　　3.2?采用桑树锯木屑和鲜桑树枝木段作培养基对桑黄菌进行模拟野生生态条件培养，可促使人工培养桑黄长出菌蕾，但子实体生长不正常，其机理尚有待于进一步的研究。