菌种的传代与保存内蒙古自治区药品检定所的菌种是微生物学和生命科学研究的基础材料。在医学领域，诊断产品的制备、细菌疫苗的生产、微生物致病性的研究、药物的抗菌性能检测和药物微生物检验都有一整套的菌株。微生物具有生命力，在传代过程中容易发生变异甚至死亡。因此，菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的重要组成部分。这也是药物微生物学工作中的常用技术。例如，药品中对照菌检验所用的阳性对照菌，必须防止阳性对照菌典型生物学特性的改变和菌株因多次传代而死亡，以保证长效性。术语正确的细菌形状；在此过程中，必须妥善保存检出的疑似致病菌，以达到进一步鉴定的目的，确保用药安全。 2.菌株编码的意义国内药学微生物检测使用的菌株编码为CMCC(F)或CMCC(B)CMCC ——。中国医学菌种保藏中心B ——代表细菌，F ——代表真菌。大肠杆菌[CMCC (B) 44102] 副伤寒沙门氏菌B [CMCC (B) 50094] 铜绿假单胞菌[CMCC (B) 10104] 金黄色葡萄球菌[CMCC (B) 26003] 产孢梭菌[CMCC (B) 64941] 白色念珠菌[CMCC (F)98001] 3.常用菌种保藏方法(1)菌种保藏原则根据微生物菌种的生理生化特性，在人工创造的条件下，尽量减少微生物的数量。细胞的代谢强度使细胞基本处于休眠状态，生长繁殖受到抑制而不是死亡，从而降低细菌的变异率。低温、干燥、缺氧、缺乏营养物质等环境条件都有抑制微生物新陈代谢的作用。低温、干燥、真空是菌种保存的重要手段。在选择保藏方法时，首先应考虑该方法能否长期保持菌株原有特性，同时还要考虑该方法的经济性和简便性。在实际工作中，往往会同时使用多种条件来提高保鲜效果。 (2)菌种保存步骤选择具有典型特征的纯菌落； 确定适合保存的菌型； 选择最合适的保存方法； 定期检查保藏菌种，观察是否有变化，必须改变保藏方法。贮藏期满应及时移栽。一、琼脂斜面低温保存法（一）方法：将常用菌的典型菌落接种于斜面上（部分特殊菌可用液体培养基），按规定的温度和时间培养，待充分生长后，用牛皮纸保存培养的新鲜菌种。为减缓培养基水分蒸发，延长保存时间，可将菌种保存管的棉塞换成橡皮塞。储存在4C 左右的冰箱中。每2-3个月移植一次并继续保存。若采用半固体高层培养基进行穿刺培养，一般可保存半年至一年。有些甚至更长。 (2)适用范围：细菌、酵母菌、霉菌的保鲜。大肠杆菌大肠杆菌金黄色葡萄球菌产孢梭菌白色念珠菌好氧菌、厌氧菌培养基真菌培养基各菌种贮藏条件及时间（4）注意事项：保藏菌种应旺盛新鲜培养至少应传代至第三代。为了保存，Tetani 可以使用煮肉介质；产孢梭菌可以使用流体巯基乙酸盐培养基。需要定期检查冰箱储菌的温度和湿度，菌管的棉塞是否松动、发霉。如有异常，应及时处理。每次移植后，应一一核对原菌的序号和名称，确认培养基特性和纯度无误后，方可继续保存。保藏菌种培养基应无糖，其他菌类含糖量应低于2%，以免产酸过多影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易自溶死亡，不宜用此法保存。 2、液体石蜡保存法：该法利用石蜡将培养物与空气隔离，从而降低菌种的生理生化水平，防止水分蒸发，从而延长菌种的保存期。 (1)方法：将菌株斜面或穿刺接种于0.3-0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养备用。
将化学纯液体石蜡装入试管中，每管10-15ml，加棉塞，用纸包好瓶口，121高压灭菌30min，取出置于37培养箱或恒温箱中110-170C 烘箱1-2 小时或用干燥器除去液体石蜡中的水分。将上述液体石蜡加入培养菌试管中。液体石蜡液面应高于培养基最上部1cm。将试管竖直放置于4C 冰箱中。适用范围：适用于部分霉菌、酵母菌、放线菌的保鲜，对细菌的保鲜效果较差。液体石蜡对各种菌种保存的影响（三）特点：该方法简单易行，是实验室常用的保存方法。这种方法主要是隔离空气中的菌株。 (4)注意事项： 保藏时，用新鲜培养物接种，保藏前检查纯度和性状。 在存放过程中，要经常观察斜面是否干燥。如果干燥，则需要重新移植。 使用菌种时，先将菌管倾斜，让液体石蜡流向一侧，然后用接种针挑取培养物，接种到新鲜的斜坡上进行培养。待新培养物长出后，再移植到新坡上即可使用。 4.试验所用菌株培养及传代程序：冻干菌回收————接种（斜面）（菌传代）（营养肉汤）制备菌悬液对照菌液试验标准菌株，中国菌检所药物生物学控制以冻干菌株形式提供。菌种的回收和保存在专用的无菌室或超净工作台内进行。 2 菌株传代
与保存 方法（1）： 菌斜面 菌斜面（保存） • 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。 • 点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。• 堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。• 取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。• 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般 3个月转种一次。
常用分离平板：大肠埃希菌——EMB琼脂平板铜绿假单胞菌—— 溴化十六烷三甲铵琼脂培养基
3 菌悬液的制备 取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后, 用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌), 将已接种毕的细菌管置35~37℃培养18~24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用7天。
4 对照用菌液制备 取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1 ml加到9ml 0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2 ……以此类推，稀释至含活菌数在 50 ~ 100 个。用平板计数。 此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在1天内使用。
五、菌种保管 • 菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。 • 菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。 • 各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。 • 购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。
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