食药用菌菌种生产相关技术

能否生产出合格菌种？是评价一家专业生产食用菌和药用菌的企业是否“专业”的标准。更重要的是，自繁菌株可以大大降低买种成本，从而提高经济效益。食用菌和药用菌的来源一般有两种途径：一是通过组织或孢子分离技术自繁自繁，二是从有关科研部门引进。 1、菌种分离食用菌和药用菌的分离有两种方法：组织分离法和孢子分离法。这些方法为科研院所普遍采用，分离出的菌种必须进行果品种比对试验，才能推广应用。 (1) 组织分离该方法属于无性繁殖或克隆技术。从理论上讲，获得的菌株不进行基因重组等变异，因此常用于生产。选用无污染、菇形健壮（6分钟成熟）的食用、药用幼菇，装入消毒过的纸袋中，采摘后及时带回接种室，放入接种箱中与试管培养基一起对母种进行内部消毒。接种箱内无菌操作时，先用75%酒精对手和工具进行消毒，然后用0.1%水银溶液对菇体表面进行消毒，用消过毒的手术刀从间接缝中间纵向切开。菌盖和菌柄打开，在菌盖和菌柄连接处剪下长条状的小块（图6-1），用接种钩挑起小块菌肉，快速插入菌肉中间倾斜培养基，用棉塞塞住，25孵育。培养3-5天后，可见组织块周围长出白色稀疏细长的菌丝。 15-18天后，菌丝体即可覆盖试管。选择菌丝旺盛、无污染的试管进行转移繁殖。经出菇试验合格后方可用于生产。图6-1 从组织中分离出的细菌(ii) 孢子分离该方法为有性繁殖，获得的菌种经过基因重组等变异，生产性状可能优于母体，也可能不如母体。孢子分离有两种方法：单孢子分离法和多孢子分离法。单孢子分离主要用于遗传育种研究，多孢子分离多用于生产和育种。孢子分离技术如下：钩悬液采集法采用成熟的子实体（刚喷出的孢子）帽块，经无菌室消毒后，将菌鳃（toadstool）或孔（polypore）向下悬挂，收集孢子于一个无菌容器（图6-2），让它在22-26自然喷出孢子5-10小时，容器底部出现白色孢子印。取无菌水，沾取少量孢子制成孢子悬液，用灭菌注射器或滴管吸取孢子悬液，滴1-2滴于试管斜面上，25培养至孢子出现发芽，选择无公害的斜面进行繁殖，经过严格的结果检验，选出最好的进行生产。图6-2 悬垂菇体采集孢子1.挂钩2.菇体3.培养基试管采集方法在无菌条件下取一小块子实体组织，蘸取少量无菌琼脂或糊状物，贴于将试管在与培养基斜面相对的玻璃壁上（图6-3），加一个棉塞，静置在20左右。孔隙组织中的孢子会被喷射到斜面上的培养基中，从而去除试管壁上的细菌。进一步培养得到长出多孢子的菌丝体。图6-3 试管斜面采集孢子2、母种的制作在食用药用菌菌种的生产中，通常将菌种的制作分为母种和原种两个层次。母种又称一级种，因菌丝长在试管斜面上，故又称试管种或斜面种。为保证品质，防止退化，母种转扩次数不宜超过3次，转扩次数增多，产量趋于下降。对于保存时间较长的菌种，复壮后必须进行出菇试验，方可用于规模化生产或销售。一般由生产者引进母种，用于繁殖后制备原种。 (1)母种培养基配方琼脂常用作母种培养基的凝固剂，又称琼脂或冻粉，是从海藻百合菜花或其他红藻中提取加工而成，透明、无味、粉状或粉末。琼脂的主要化学成分是聚半乳糖硫酸盐，包括D-葡萄糖醛酸、L-半乳糖、D-半乳糖、3,6-脱水-L-半乳糖和丙酮酸。干琼脂一般含有16%的水、4.4%的灰分、1.15%的氧化钙、0.77%的氧化镁和0.4%的氮。琼脂化学结构稳定，不易被菌丝体分解利用。它仅在介质中起凝固剂的作用。它在96C 时熔化为液体，冷却至45C 以下时重新凝固。

由于用琼脂配制的固体培养基清澈透明，便于观察菌丝体形态，因此成为常规斜场平板培养基不可缺少的材料。其用量随使用季节、用途和琼脂本身的质量而变化。一般冬季添加1.5%-1.8%，夏季添加2%；分离菌株时添加2.5%，生产时添加1.5%-2%。如果用量过多，介质较硬，保水性好，不易干燥，但成本高。需要指出的是，即使是最纯的琼脂，也会含有微量的含氮化合物和残留的无机盐，因此在营养要求精确的实验中最好不要使用琼脂。生产上要求培养基营养丰富，菌丝旺盛，故采用各种增菌培养基。常用原种培养基如下： 1、马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基（PDA）：去皮马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，水1000毫升。这种培养基营养成分少，菌丝不会过度生长。常用于菌株分离、纯化和转管保存。 2、去皮土豆200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，维生素B 120毫克，琼脂20克，水1000毫升。 3、去皮土豆200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，板栗木屑100克，水1000毫升。 4、高粱粉50克，葡萄糖10克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁0.5克，琼脂20克，水1000毫升。 5、平菇200克，葡萄糖20克，磷酸二氢钾2.5克，硫酸镁0.5克，蛋白胨3克，琼脂20克，水1000毫升。 （二）试管斜面的制备1、培养基制备选用优质马铃薯，去皮（挖出芽眼），切成薄片，称200克，加水1000毫升，放入小铝锅煮20-30分钟，趁热用3分钟，用一层纱布过滤后，取滤液，加热水至1000毫升，倒回小铝锅中。加入琼脂继续加热，用玻璃棒搅拌至琼脂完全溶解，再加入葡萄糖，再补水至1000毫升。 2分钟

　　为2种∶18毫米×18毫米及20毫米×20毫米，培养基装量为10-15毫升，为试管长度的1/4-1/5，培养基不可沾附试管内壁，如有沾附物必须擦试干净。

　　3.做棉塞 取适量棉花制作棉塞，棉塞要做的圆滑硬实，棉塞总长3-4厘米。标准的棉塞应是塞头较大，不易变形，入管的部分占塞总长的2/3，露在管外的部分则为1/3(不少于l厘米) 。棉塞的大小、松紧要与试管口配套，塞入试管的棉塞要紧贴管壁，不留缝隙。过紧妨碍空气流通，也不便操作;过松则达不到滤菌目的，且棉塞易掉入或脱离试管。松紧度以提起棉塞而试管不脱落，拨出棉塞有轻微的声音为适宜。

　　4.灭菌 将6-8支试管捆成1把，上面用牛皮纸或双层报纸包住，用皮筋或线绳扎紧，以防棉塞受潮。直立放在高压锅内灭菌。加热灭菌时，排尽锅内冷气，当温度升到121℃(压力1.0千克/平方厘米)时，维持30-40分钟后停止加热，待指针回到零点，先打开锅盖的1/5，利用余热烘干棉塞，等到无直冲蒸汽时，再打开锅盖，取出试管。

　　5.摆斜面 趁热将试管一端垫放到木条上，使其成一定角度的斜面，一般斜面长度达试管全长的1/2为宜。气温低时，覆盖保温，以防冷凝水过多，待完全凝固后，收取备用。

　　6.灭菌效果检查 随机抽取5支试管，在25℃下进行空白培养3-5天后，检查斜面上有无杂菌，如果发现有杂菌，说明灭菌不彻底，要废弃或重新灭菌，无杂菌出现即可供接种用。

　　㈢ 接种与培养

　　l.灭菌 接种前先将接种用具、培养基以及菌种等放到接种箱(或接种室)内，然后按每立方米用高锰酸钾5克，40%甲醛溶液10毫升的量进行熏蒸消毒30分钟，如有紫外线灭菌灯，同时开启照射30分钟后进行接种。

　　2.接种 接种时试管口不要离开酒精灯火焰旁的无菌区，灼烧一下接种钩并待其冷却，将斜面上的菌苔纵横划切成米粒大的小块（图6-4），深度以稍带培养基为适，然后再取种块迅速放到待接试管斜面的中心位置，抽出接种钩后，再把试管口烘烧一下，棉塞过火后迅速塞好。如此反复接种，一般每支母种可转接30-50支试管。

　　3.培养 将接种后的试管放入25℃的培养箱或培养室进行

　　恒温培养，灰树花需要12-15天的培养，菌丝才能长满试管斜面。在培养过程中要随时检查，挑除有杂菌感染或有异常现象的试管，以保证母种的质量。

　　图6-4 母种转接方法（仿陈士瑜）

　　三、原种制作

　　原种是将母种转接于装有培养料的菌种瓶或袋中进行扩大培养的菌种(二级种)。原种制备程序如下：

　　㈠ 配方与拌料

　　1. 阔叶树的木屑78%，麸皮20%，红糖(或白糖)1%，石膏1%。含水量在60%左右，PH值5.5-6.5。

　　2. 棉籽壳90%，麸皮8%，红糖1%，石膏1%。含水量在60%左右，PH值5.5-6.5。

　　3. 棉籽壳42%，木屑40%，麸皮16%，红糖1%，石膏1%。含水量在60%左右，PH值5.5-6.5。

　　4. 麦粒99%，石膏1%。麦粒用1%石灰水浸泡12-24小时(因气温而定)，加热煮沸15分钟，以麦粒不开花为适，然后捞出麦粒稍微晾干，拌入石膏立即装专用菌种瓶或输液瓶，每瓶装湿麦粒300克，瓶肩处装一薄层棉籽壳封口料，以减少杂菌污染。

　　在配料过程中，要注意以下几点:

　　⑴锯木屑要过2-3目筛，除掉木块、木条、木片、霉料团等硬物，按照生产计划配料，用机器或人工充分拌匀，将红糖溶于水中，随水均匀拌入料内。要做到主、辅料均匀，干湿均匀，酸碱度适宜，无生料团。

　　⑵搞好环境卫生，拌料的场地最好是水泥地，要提前用水冲刷干净，尽量减少污染。

　　⑶灵活掌握含水量，对干料、细料加水宜多一些;对湿料、粗料加水宜少一些。在水泥场地拌料加水宜少一些，以干泥渗水场地拌料，加水宜多一些，具体加水量以拌好料堆闷半小时后，用手紧握料有水从指缝渗出、但不成滴下落即可。

　　⑷操作要快速 在气温高时(28℃左右)，如拌料至灭菌时间过长，则料易变酸。轻者影响发菌，重则不发菌。因此，要合理安排好生产量，保证在高温期从拌料到灭菌不超过4小时，在低温期从拌料至灭菌不要过夜。

　　㈡ 装瓶与封口 所用菌种瓶要提前刷洗干净，控干后备用。木屑或棉籽壳培养料装瓶，装料至瓶颈可用木棒压实、压平，料面须在瓶肩以下。然后要在料中间扎直径为1.5-2厘米的孔，将瓶口内外壁擦净。

　　取一块完整、略大于掌心的棉絮卷成棉塞，棉塞要比瓶口略粗，稍用力即可旋入瓶口为宜。塞入瓶口2/3、外露l/3，棉塞头部与瓶颈的底口平，要松紧适度。过紧，影响通气，发菌慢。过松不但棉塞易脱落，且起不到过滤杂菌的目的，引起杂菌感染。塞好棉塞后，盖上牛皮纸或双层报纸，用皮筋扎紧。

　　㈢ 灭菌 采用高压灭菌或常压灭菌。高压灭菌的压力通常为1.5-2千克/平方厘米，灭菌时间为2-2.5小时。常压灭菌需8-10小时。

　　㈣ 接种 接种前必须使瓶温降至30℃左右，防止高温接种热死菌种。有冷却室的在冷却室冷却，没有冷却室的可直接在接种室冷却。每支母种可转接3-4瓶原种。接种前，首先把接种室(箱)打扫干净，喷2%来苏尔或新洁尔灭净化空气，再把已灭菌的菌种瓶及用具全部搬进去，然后按常规对接种室(箱)进行严格消毒。接种需严格按照无菌操作进行。

　　具体操作方法是∶ 接种者手持母种试管，用酒精棉球将试管擦2次，然后拔开棉塞，试管口对准酒精灯火焰上方，用火焰烧一下管口，把烧过的接种耙迅速插入种管内贴玻壁冷却，将斜面前端1厘米长的菌丝块挖去，剩余的斜面分成3-4段，另一个人在酒精灯火焰上方，在接种者取好菌种块的同时拔开原种瓶棉塞，接种者将菌种块取出，快速接入原种瓶的接种穴内，棉塞过火焰后塞好。如此一支试管可接3-4瓶原种。每接完一支试管，接种耙要重新消毒，防止交叉感染。接完种后，立即将台面收拾干净，将各种残物如试管、洒落的培养基、消毒用过的棉花等均清出室外，照前述方法进行第二轮接种。

　　㈤ 培养 原种培养须注意如下事项：

　　1. 提前几天打扫培养室，对水泥墙壁、地面要进行清洗，并严格消毒处理后方可使用。培养室要求保持空气干燥、清洁、避强光，留有能启闭的通风口，空气流通无死角。

　　2. 将接种后的原种瓶搬入培养室，保持温度在25℃左右，保持空气湿度55-65%。一般3-5天菌丝即可吃料，7-10天菌丝即可封面。待菌丝封面后，加强通风换气，保持室内空气新鲜，一般培养25-85天菌丝即可长满瓶。

　　3. 培养期间要随时检查，发现污染杂菌应及时采取措施。原种瓶内杂菌滋生部位不同，其污染原因亦不同:如棉塞受潮，空气湿度过大，瓶口部位易滋生红色链孢霉。如瓶内上下均发生绿霉及毛霉等杂菌，则可能是灭菌不彻底。如随机发现接种块四周发生杂菌，则可能是接种操作不熟练或棉塞过松所致。如紧邻几瓶的种块全部滋生杂菌，可能是母种带杂菌或接种工具灼烧灭菌不严。不管那种情况，一发现杂菌危害后，必须及早清除，以防蔓延导致大批菌瓶发生杂菌感染。初期污染的种瓶可重新彻底灭菌，重新接种，不可延误。

　　除染杂菌外，有时种块不萌发。其原因是:一是接种工具灼

　　烧后未冷却就挖取菌种块，菌丝被烫死或菌丝过火焰时被火焰烧死。二是母种干缩老化，失去萌发力。三是培养温度不适宜，菌种瓶灭菌后未冷却，菌种受热而死。

　　有时菌种块虽能萌发，但不吃料，其原因主要是：菌种块与培养料结合不紧密;培养料偏干;培养料的酸碱度不适宜;培养料内加入了过量抗杂菌药物如多菌灵等。因此接种时要使菌种块与培养料紧密结合;坚持随拌料随装瓶，及时灭菌防止培养料变酸;选用木屑时要严防混入松柏木屑;配料时不要随意添加或过量添加多菌灵等抑菌药物，以防菌丝生长受到抑制;要保持室内空气湿度55-65%，要远离热源，使种瓶受热均匀。

　　㈥ 原种标准 优良原种的主要标准是：

　　1. 菌丝洁白无杂菌，棉塞纸盖均无霉点，菌丝满瓶。菌丝长满瓶后，表面分泌茶色液滴，有少数原基形成，可视为正常。

　　2. 打开瓶塞有食药用菌独特的芳香味，无霉味和酸臭味。

　　3. 从原种瓶中随机挖取一块菌种，成块而有韧性，不松散。将种块接于新的培养基上，在25℃下培养菌种萌发正常。

　　劣质原种的表现是菌丝表面出现杂菌斑纹(拮抗线)，菌丝细弱，脱壁萎缩，发黄老化，这样的原种不能用于生产。

　　四、栽培种制做

　　栽培种培养基的配制、接种及培养方法和原种基本相同，主要不同点有二: 一是原种用试管母种进行接种繁殖，而栽培种是以原种再接种繁殖；二是栽培种所用的容器除了菌种瓶、罐头瓶外，还可用各种规格的聚丙烯塑料袋做培养料容器。

　　五、菌种的保藏

　　菌种保藏是食药用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。

　　一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此保存方法应具备取材容易，操作方便，菌种不易退化，长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下∶

　　㈠ 斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是:菌丝长满斜面后，放在0-5℃保存。以后每隔一定时间(2-3个月)转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，食药用菌降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5-3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。

　　斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。用该法须注意以下几点∶

　　1.贫、富培养基轮用 笔者在多年的菌种保藏实践中发现，保存菌种的培养基不能营养太丰富，否则菌丝生长过旺易老化，且产生较多的有害代谢物而导致菌种死亡。因此大都采用营养不怎么丰富的马铃薯-葡萄糖-琼脂斜面（PDA）。食药用菌在PDA培养基生长虽细弱，但不易老化、生命保持期长；而在加富（如蛋白胨、酵母膏、麸皮浸液等）的PDA培养基上菌丝生长虽旺盛，但易老化、生命保持期短。因此，灰树花斜面菌种轮用贫、富培养基保藏，有利于其优良种性的保持和复壮。

　　2.经常更换培养基 同一菌株若长期使用某一培养基，菌丝的生长速度减慢，会出现菌丝细弱、断节、稀疏的现象，这是因为菌丝一直生长在半合成的同一基质上，与其自然生长环境不同，某些酶和活性物质长期得不到启用，会钝化或丧失活力。通过更换培养基，特别是天然营养物质的更换能改变碳、氮、矿质元素成分，恢复菌丝活力。

　　3.菌龄和保藏温度须适合 待保藏菌种的菌丝培养菌龄与保藏期的长短有关。如木耳、姬松茸的菌丝长满斜面后再培养2-3天，让菌丝更浓密、粗壮，有利于菌种对低温的抵御，冰箱温度设置在4-8℃，可延长菌种的生命活力；而平菇、金针菇等菌种在菌丝刚长满或将长满斜面时即可放入冰箱，这些品种的菌丝本身耐低温，在低温条件下也能缓慢生长，冰箱的保藏温度最好在0-4℃，可延缓金针菇斜面产生子实体。

　　4.有孔胶塞封口延长保藏期 棉塞封口培养基易失水干缩；而用无孔胶塞封口造成缺氧，菌丝会因缺氧而死亡或发生生理反应(菌丝或基质产生色素)。如在胶塞上钻孔，孔径1.5毫米，再用棉花封孔口来协调保水与通气的矛盾，菌种贮藏9-12个月后仍能成活80%以上。

　　㈡ 自然基质保藏 此法是根据食药用菌的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。木腐菌可以采用以木屑为主料的培养基，草腐菌采用以粪草为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。

　　1.原料与配方 制备木屑培养基时，采用硬木屑最佳，粗、细木屑比例要适当，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1：2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%上下。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，“架空菌丝”多，细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用方法如下：

　　木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3-1/2，1.5千克/平方厘米灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时，取出换上无菌橡皮塞，在0-5℃冰箱内保藏1-2年转管一次。

　　2.容器与装量 采用容量250毫升的葡萄玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。

　　3.灭菌和冷藏 灭菌时若采用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好采用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。

　　用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。

　　㈢ 石蜡隔氧封藏 将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的l/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1-2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1-2次，方能复壮。