羊肚菌的菌种分离与制作——组织分离

组织解剖是最常用的分离方法。这种方法比孢子分离相对简单，得到的菌株性状也比较稳定。孤立后代的基因型与父母的基因型一致，父母的优良性状可以在一定的世代范围内遗传。因此，组织分离是目前应用最广泛的分离方法。也是对某些菌株进行定向选择的一种筛选方法，但组织分离法并不是对所有材料都适用的。经验表明，对于某些类型的组织分离物，绝大多数产量都下降了，例如平菇和双孢菇。长期从事羊肚菌的朋友一定发现了，你采集的新鲜标本有一定概率是根本分不开的。这是羊肚菌组织老化的表现，绝不能使用老化的菌种进行生产。的。组织分离的具体方法如下：取半成熟至成熟健壮的新鲜子实体，用0.1%汞升或75%酒精消毒表面。如果是干标本，用无菌水摇匀，浸泡，然后用汞酸或酒精消毒。消毒前，也可以用吹风机吹掉表面附着物和细菌，用汞或酒精擦洗表面，尤其是柄部。在无菌条件下从子实体中部纵向剖开，在菌盖与菌柄交界处或较粗的部分（即远离组织表面）用锋利的工具小心取出1-3mm大小的菌组织尖头镊子或手术刀，置于合适的培养基上，在合适的温度下培养。当菌落生长到直径1-2 厘米时，转移管进行纯化。下面根据羊肚菌的特性，详细讲解羊肚菌的组织分离步骤：

1）设备及材料准备：酒精灯、打火机、75%酒精棉球、手术刀、尖嘴镊子、尖嘴镊子、采摘针或接种针、无菌吸水纸或滤纸、75%酒精或0.1%汞氯化物（氯化汞）溶液、无菌蒸馏水、倾倒介质的倾斜试管或平板、超净工作台、待分离的新鲜羊肚菌子囊果。

2) 将上述器具放在超净工作台上，打开紫外线灯，表面消毒20-30分钟；然后关闭紫外灯，放入待分离的子囊标本；打开风扇，以中高风速吹5-10分钟。

3）打开超净工作台的白炽灯，风速可以降到中低档；用75%酒精棉球擦拭双手进行表面消毒，然后用新鲜的75%酒精棉球擦拭超净工作台表面。

4）用微干的酒精棉球擦拭干净子囊菌柄，特别是基部与土壤交界处的灰尘或泥土，擦拭过程中及时更换酒精棉球；用手术刀将清洗干净的子囊果柄0.51cm的组织块切成2~3块，或取柄与菌盖交界处组织较厚的部分；将组织块在0.1%氯化汞溶液中浸泡0.5~1分钟（或75%酒精浸泡2~3分钟），视材料不同，需调整浸泡时间。可以从短时间开始，观察效果，以免氯化汞或酒精将羊肚菌菌丝全部杀死。

5) 取出浸泡在氯化汞或酒精溶液中的组织块，用无菌蒸馏水冲洗1 min，取出后置于无菌吸水纸上，吸干水分。

6) 用干净的尖头镊子或手术刀撕开菌肉，尽可能取下内部组织0.2-0.3mm，置于斜面或平板培养基上；在倾斜或平板介质上。

7) 封板后将平板倒置或倒置，置于20-23恒温培养箱中培养。

8) 36~48小时后，检查接种块是否发芽。初期萌发的菌丝稀疏，每根清晰可见，长约0.2-0.4厘米，菌丝较粗； 56-72小时后，发芽成功的菌丝长到0.5-1.5厘米长，菌丝细长，无色，不致密，前端几乎完整，根系分明。这时候可以摘取菌落的尖端进行纯化，或者最多等一天再摘取纯化。

9) 羊肚菌提纯后约8-12小时，即可看到从接种块到培养基中萌发的新菌丝。新菌丝初始形态与8)所述状态一致，稀疏、无色、细、根根清晰；通常18180mm的倾斜试管4~5天左右即可覆盖试管，并具有一定的爬壁能力。但菌丝明显，菌落前端略整齐，并有齐头并进之势。 47天，培养基表面开始形成直径约1mm的白色、针状、不规则颗粒状白色菌核。根据分离的物种，菌核分散或聚集成薄片。第710天，菌核初为白色小块，逐渐变为淡黄色大块。根据品种的不同，菌丝开始出现少许色素沉着，菌丝开始有初始的无色、白色到浅黄色、浅棕色。 10) 培养1014天后，将培养物转移至4冰箱中保存备用。

对于干燥标本的材料，可以按照新鲜标本的操作规程用无菌水进行溶胀后再分离，但难度要比新鲜标本大很多。

对于相对干净的年轻组织材料，可以跳过水银浸泡过程。表面去除消毒后，用手术刀将子囊果剖开，尽量将未暴露在空气中的组织分开。熟练的人还是可以取得很好的效果的。 （来源：羊肚菌生物学与栽培技术）