食用菌分子生物学研究进展

由于现代分子生物学的不断发展，生命科学逐渐成为21世纪科技革命的主流。与动植物相比，食用菌的分子生物学研究起步较晚。同时，由于食用菌市场狭小，缺乏大量研究投入，食用菌的分子生物学研究相对滞后。但由于食用菌生命周期短、基因组小、实验操作技术简单等特点，引起了遗传学家和育种家的重视。这是食用菌遗传育种研究，尤其是分子生物学研究迅速发展的主要原因。食用菌以其特殊的香味、低热量、低脂肪的营养特性，以及降血压、抗肿瘤、增强机体免疫力等功效，越来越受到消费者的青睐。传统的基因育种方法周期长，见效慢。现代分子生物技术为筛选高产、优质、抗逆、适应性强的菌株提供了更高效、更快捷的物种转化方法。作者对食用菌分子生物学的研究，希望能为相关研究和应用提供参考。 1 食用菌转基因研究最早报道的食用菌转化是Challen等。采用聚乙二醇（PEG）法将外源DNA导入双孢蘑菇Imbach原生质体中，获得转化子。后来，有学者报道了数例对Pleurotus treatus Quel.Volvariella volvacea Sing.Agrocybe aegerita Sing.等食用菌进行遗传改造的案例。和香菇。成功。 1.1 常用筛选标记目前，常用的食用菌筛选标记主要包括营养缺陷型标记、抗生素抗性标记和代谢物抗性标记三类。 1.1.1 营养缺陷型标记标记基因来源于宿主自身，属于同源转化，很容易在染色体的同源部分引导载体整合和基因表达。目前，Ural（二氢乳清酸）、Pabl（对氨基苯甲酸）、rr#（色氨酸）等营养缺陷型标记基因已成功应用于杨树菇和灰盖鬼伞（Coprinus cinereus s.F.Gray），报道于双孢蘑菇的遗传转化。基于同源转化的高转化率和高安全性，营养缺陷型标记是优良的选择标记，但食用菌营养缺陷型菌株不易获得，限制了该选择标记的应用。 1.1.2 抗生素选择标记用于食用菌转化研究的抗性标记基因有潮霉素抗性基因（Hygr或Hpt）、腐草霉素抗性基因（Phlr）、博来霉素抗性基因（Bler）等。其中，应用最为广泛的潮霉素抗性基因Hygr已在平菇、香菇和双孢蘑菇中得到表达，在香菇的转化中具有较好的效果。 1.1.3 代谢物抗性标记r,p3突变基因Trp3iar来源于灰盖鬼伞分离的5-FI抗性菌株，是第一个从担子菌中分离得到的阳性标记基因，可导致代谢物抗性5-氟吲哚（5-氟吲哚，5-FI) 耐药性；以Trp3iar为选择标记对平菇和草菇进行转化，获得了5-FI抗性转化子。该标记基因属于近同源基因转化，不易甲基化，易于表达，适用于食用菌遗传转化。 1.2 常用启动子目前在食用菌转化领域，对启动子的研究主要集中在强启动子和同源启动子上，因为不同的启动子会影响食用菌的转化效率和外源基因的表达。目前常用的启动子主要有RAS基因启动子和GPD基因启动子。 1.3 常用方法食用菌的遗传转化方法大多借鉴了动植物和微生物的成功转化方法。目前主要有以下几种： 1.3.1 聚乙二醇法（PEG） PEG法对原生质体的相对损伤小而简单，是食用菌遗传转化中应用最广泛的方法，已成功应用于双孢蘑菇、平菇、草菇等食用菌。王春晖等。等采用PEG法将平菇DNA导入草菇原生质体中，培育出出菇类型、酶活性和生物转化率均与亲本有显着差异的V157-1菌株。但这种方法转化率较低，一般为10-510-6。

1.3.2 电击法Challen 等人。首先应用该方法将URA1转入同源的杨木菇营养缺陷株获得转化子，用于双孢蘑菇和平菇的转化。贾建航等。利用该技术将香菇和平菇的DNA分别导入平菇和杏鲍菇的原生质体中，获得转化子。与PEG法相比，电击法可电击原生质体、菌丝体或完整细胞，操作简便，所需DNA较少，但对转化体的损伤较大，转化率较低。 1.3.3 限制酶介导整合（Restriction enzyme-mediated integration, REMI） Sehiestl等。 1991年首次使用该方法成功转化酿酒酵母。对担子菌纲灰盖鬼伞和香菇的改造获得成功。由于限制性内切酶的定位，REMI法可以大大提高整合率，从而大大提高转化率，但酶的种类和浓度会影响转化率，容易引起突变，产生假阳性. 1.3.4 农杆菌介导的转化方法De-Groot 等。 1998年首次用这种方法转化丝状真菌（曲霉启动子），但转化率很低。随后，将双孢蘑菇的幼鳃组织、菌丝体和担子孢子萌发菌丝与农杆菌共培养，获得稳定的转化体，转化率高达30%40%，说明同源启动子转化率高。利奇等人。用此方法转化双孢蘑菇和枯草芽孢杆菌（BaciUu subtilis）（Ehrenbe

　　1．4　存在问题

    目前在食用菌的转化研究中主要存在假阳性菌落的干扰、外源DNA整合率、外源基因整合后表达率不高以及转化子不稳定等问题．其中影响转化的主要因素是低整合率和低表达率．因此在未来食用菌转化研究方面仍然需要继续探讨转化方法、转化材料、标记基因、启动子等，建立一个完善的转化体系，如引入特殊序列、构建高效表达载体、使用增强子等．从而提高遗传转化的整合率和表达率。

　　2 DNA分子标记研究

　　随着分子生物学技术的发展，目前已经开发了几十种基于DNA序列多态性的分子标记，如随机扩增多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单序列长度多态性(sSLP)、简单重复序列间扩增(Is— sR)、序列标记位点(STS)、单核苷酸多态性标记(SNP)、特征片段扩增区域(sCAR)、核糖体DNA(rD— NA)、相关序列扩增多态性(sRAP)、靶位区域扩增多态性(TRAP)等，并应用于食用菌的种质资源与菌种菌株鉴定、遗传多样性与亲缘关系分析、遗传图谱构建及基因定位和克隆等研究领域。

　　2．1　在杂交子、融合子鉴定中的应用

    大多数食用菌的遗传背景不清楚，其形态特征也难于观察和描述，使食用菌育种和遗传分析因缺乏标记而难以深人．分子标记的应用，使食用菌的遗传育种研究有了飞速的发展．在杂交育种中，亲本菌株的选择和对杂种的准确鉴定是关键技术，通常传统的鉴定方法不能从本质上揭示亲本固有的遗传差异，因而在准确性、稳定性或灵敏性方面都不太理想．Khush等1992年首次报道了采用聚合酶链式反应(PCR)技术构建双孢蘑菇的分子标记．之后RAPD、AP-PCR、rDNA、SCAR等分子标记也被相继应用于双孢蘑菇、香菇、金针菇(Flammulina velut咖es Sing．)、凤尾菇(Lentinus sajor-caju)、黑木耳(Auricularia auriculaUnderw)、野蘑菇(Agaricus arven~is)以及褐色蘑菇(Agaricus 6函porus)等食用菌研究中旧射。

　　用RAPD技术对香菇的亲本与后代之间进行遗传相关性分析，发现非对称杂交的后代遗传距离与单核受体较近，与双核供体遗传距离较远口副；双单杂交菌株后代基因组也存在不同程度变异。

　　2．2　在菌种及种质资源鉴定上的应用

　　目前在食用菌生产上主要存在品种退化、菌种老化、病毒感染、品种混杂和杂菌污染等问题，尤其是同种异名、异种同名的现象十分普遍．分子标记技术的发展，给快速鉴定食用菌菌种及种质资源带来方便。

　　RAPD技术是一种快速有效鉴别菌株的方法，广泛应用于金针菇、香菇、木耳、白灵侧耳(Pleurotus nebrodensis Qu61)、灵芝(Ganoderma)、银耳(Tremella如扣rmis Berk)、牛肝菌(Boletus edulis BuU．ex Fr．)等的子实体及组织分离物的DNA多态性分析旧H¨．此外SRAP、ITS(Internal transcribed spacer)、ISSR等方法也有应用[46-50]．如秦莲花等以ISSR引物对香菇属的13个菌株的微卫星区DNA进行扩增，确认了香菇中微卫星(TATG)n序列的存在，认为此标记可用于香菇菌株的遗传分类研究。

　　2．3  食用菌性状的连锁标记筛选与遗传图谱

　　目前，找到与食用菌一些性状相连锁的分子标记比较少。而在遗传图谱研究方面，近年来用分子标记仅构建了双孢蘑菇和糙皮侧耳的遗传连锁图。双孢蘑菇的遗传连锁图是一个集同工酶、RFLP、RAPD、rDNA重复序列以及少量外部表型性状等多种标记的混合标记连锁图，它的建立将为今后进一步分析双孢蘑菇的遗传行为，定位或克隆有关基因提供了一个很好的参照标尺。糙皮侧耳的遗传图谱以RAPD标记为主，辅以RFLP、同工酶、表型(交配因子)标记，该图谱包括了189个位点，分属11个连锁群，覆盖的基因组总长度为1000．7 cm，标记间平均距离为5．3 cm．最近又构建了二极交配型Pho— liota nameko的不亲和性相关蛋白基因(Hoxl)的连锁图。此外用白色金针菇子实体和黑木耳不同交配型的单倍体菌株进行RAPD分析找到了连锁基因。

　　2．4　食用菌遗传多样性研究

    目前，通过分子标记揭示不同物种DNA分子水平上的多态性用于食用菌野生种质资源的收集、保存、评价和利用，以及食用菌种质资源的生物多态性和遗传多样性，已成为食用菌遗传育种领域中一个重要的研究方向．应用RAPD、RFLP等分子标记在香菇、双孢蘑菇、侧耳、金针菇、柳松菇(Agrocybe cylindra- ce口)、羊肚菌(Morchella esculenta Pers．)、松茸(Tr／cho／oma matsutake)、秀珍菇(Pleurotus pulmonarius)、乳菇(Lactarius deliciosus Gray)等的研究报道较多．另外，应用分子标记进行真菌遗传多样性和亲缘关系分析在灵芝属(Ganoderma)、蜜环菌属(Armillaria)、块菌属(Tube)、木耳属(Auricularia)、鹅膏菌属(Amanita)等属种上也有一些报道L64-65j．利用ISSR标记研究松口蘑(Tr／cho／oma matsutake)和隐花青鹅膏菌(Amanita angiana)的居群遗传结构，结果表明遗传变异主要表现在同年生子实体内，隔年生子实体的变异情况也有表现；此外，隔年生子实体的遗传相似性和空间分布关系不完全相同旧。有学者用ISSR、RELP、RFLP技术对高卢蜜环菌(Amillaria gaUica)、侧耳属菌株、双孢蘑菇、白灵菇(Pleurotus nebrodensis Qu61)、草菇等多个菌株间的遗传系统进化关系进行了研究，发现双孢蘑菇居群和侧耳属菌株存在很高的遗传多样性，而草菇菌株间遗传差异性小。

　　在食用菌遗传改良过程中，寻找和收集遗传变异丰富的种质资源，以及最大限度地开发利用现有的种质资源至关重要．种质资源的全面而有效评估是一个非常复杂的问题，将现代分子生物学技术结合传统的形态学、生理学研究方法，形成一套有效的从生理形态到细胞、基因水平的种质资源评估方法，将对食用菌的遗传改良起重要作用。

　　2．5　食用菌基因克隆研究

　　目前在食用菌上克隆的基因不是很多．取得成功的主要有草菇漆酶基因和内切葡聚糖酶基因、香菇线粒体加工肽p亚基基因和疏水蛋白基因、灰盖鬼伞突变体ichijiku开伞基因等，并对其基因序列特征和表达特性进行了分析。

　　3  展望

    在分子水平上对食用菌遗传物质进行改造所创造的新物种在自然演化中不一定能出现，但作为一种可控的育种手段，必将在食用菌育种中发挥重要的作用．但同时也应看到许多技术自身存在的局限性和不足，如RAPD标记技术存在假阳性高、稳定性和重复性差等缺陷，RFLP和AFLP的操作复杂、周期长、费用高等．而且目前开发的分子标记数量不足，很难找到与目标基因紧密连锁的分子标记，从而构建高精密度遗传图谱的难度很大．随着分子标记技术的深入，更多的食用菌功能基因将被标记，更高密度、更为实用有效的遗传连锁图谱将被建立，大量重要的基因将被定位、分离和克隆，这将为进一步培育高产、优质、抗病、耐贮的食用菌新品种奠定良好的基础。