猪传染性胃肠炎病毒

猪传染性胃肠炎(TGE)是一种高度传染性的猪病毒性疾病。临床特征是严重腹泻、呕吐和脱水。不同年龄和品种的猪易感，但2周以内的仔猪死亡率很高，5周以上的猪很少死亡。其他动物，包括实验动物，都没有感染。这种疾病自1933年在出现以来，在美国伊利诺伊州就有记录，此后在美国广泛传播。1946年，Doyle等人确定了这种疾病的病原体是病毒，并做了详细的报告。这种疾病1956年发生在日本，1957年发生在英国。此后，法国、荷兰、德国、匈牙利、意大利、波兰、前苏联、罗马尼亚、比利时、南斯拉夫、台湾省、马来西亚和加拿大都有报道。现在，除了阿拉斯加和北欧国家，这种疾病分布在北半球，尤其是北纬30度以北的温带到寒带地区。自20世纪60年代末以来，中国已有该病的报道。在引起猪传染性胃肠炎的病毒是冠状病毒。其他病毒如轮状病毒、腺病毒、呼肠孤病毒和肠道病毒也可引起猪的感染性腹泻。本节仅介绍猪传染性胃肠炎冠状病毒(TGEV)。

1.的形态特征通过过滤试验、超速离心和电镜观察，证明病毒颗粒直径为90 ~ 200 nm，呈圆形，部分呈椭圆形或多边形。有双层膜，胶囊上覆盖着长度为18 ~ 24 nm的花瓣状纤丝，纤丝通过微小的梗连接在胶囊表面，末端呈球形，直径约为10nm。制膜时容易使原纤维脱落，所以常常只看到胶囊的边界，或者只有胶囊的某些部位有这种花瓣状的原纤维。用磷钨酸负染后，一些病毒颗粒可以看到一个电子透明的中心或一个无特征的核心，这与粘病毒的管状或螺旋状核蛋白结构不同。最近，已经描述了在猪传染性胃肠炎病毒的颗粒中存在珠状细丝。猪传染性胃肠炎病毒的形态与鸡传染性支气管炎病毒和其他冠状病毒相似。至于病毒颗粒的大小，各书略有不同。据报道，猪肾细胞培养物中病毒颗粒的平均直径为95纳米。另有报道证明，猪小肠上皮细胞中的病毒颗粒直径为65 ~ 95 nm。病毒颗粒直径的差异可能与细胞类型和标本制备方法的不同有关，而不是菌株之间的规律性差异。

2.基因组结构的特征在的TGEV的基因组结构还没有完全阐明。Purdue 115细胞适应株基因组RNA的3’端3kb序列证明它包含了亚基因组RNA表达的所有基因组。除了mRNAE外，其他TGEV亚基因组RNA在功能上似乎是单顺反子。5’端约20kb被认为转录RNA聚合酶，在TGEV感染的细胞中已发现RNA聚合酶活性，但该蛋白至今尚未分离鉴定。

3.的这种病毒含有单链RNA。卤代脱氧尿苷不能抑制病毒增殖。用核糖核酸酶处理可以破坏病毒的传染性，但病毒可以抵抗脱氧核糖核酸酶的作用。传染性RNA已经被分离出来。病毒的包膜纤维由分子量为200kDa的多肽和糖类组成，经菠萝蛋白酶处理后消失。病毒对乙醚、氯仿和脱氧胆酸钠敏感。病毒在20%乙醚中4放置1昼夜，在氯仿中室温放置10分钟，完全失去感染性。用01%脱氧胆酸钠处理1小时后，部分失去活力。用1%十二烷基硫酸钠处理1小时后，完全失去活力。该病毒在胆汁中相当稳定。对胰酶有抵抗力。但强弱毒株对胰蛋白酶和蛋白水解酶的敏感性不同：毒力越弱的菌株，对胰蛋白酶的敏感性越高。如强毒菌株SH-17，用0.5%胰蛋白酶在37处理2h，不降低其感染性；而减毒株在37下30分钟后，对163的毒力下降99%以上。该病毒在pH 4 ~ 8范围内稳定。低温下，在pH3时仍然稳定。大多数菌株在pH2下灭活1小时。但强弱菌株对pH的敏感性不同。pH3时，病毒在37可迅速灭活，但在22灭活较慢。弱毒株To-163在22下2h完全灭活，强毒株SH-17在22下8h仍能检出活病毒。在一定的pH值下，温度越高，病毒灭活越快。当细胞培养物中的病毒在50孵育30分钟时，各学者的报告并不一致：有2 ~ 3个对数下降或只有1个对数下降。在56加热30分钟后，猪小肠内的病毒被部分灭活。65灭活45分钟或65灭活10分钟。当病毒悬浮在1mol/L氯化镁溶液中时，温度的灭活作用可以增强。传染性胃肠炎病毒对光敏感。将105份感染剂量为一半的猪的粪便放在一个盘中，在阳光下照射6小时以灭活病毒。紫外线可以迅速灭活病毒。5%石炭酸在37处理30分钟可杀死所有病毒。05%甲醛溶液在37作用20分钟也能灭活病毒。这种病毒在冷冻时极其稳定。在-18保存18个月后，病毒滴度从106下降到105。培养的病毒在-20、-40和-80保存365天后，病毒滴度无明显下降。但在37保存4天后，完全失去感染性。病毒的SH株和TO株在4能凝集鸡、小鼠和牛的红细胞，但不凝集小鼠和鹅的红细胞。

4.干扰现象部分非细胞致病性TGEV株可干扰细胞培养中伪狂犬病病毒的复制。它还能干扰细胞致病性牛腹泻粘膜病病毒的复制，因此这种干扰常被用作猪肾细胞培养物中是否存在TGEV的指示系统。方法：将供试材料接种于猪肾细胞培养物中，37培养4天，吸出感染培养液，用PBS冲洗细胞两次，然后接种牛腹泻粘膜病病毒，加入新的营养液继续培养。如果没有细胞病变效应，则证明猪肾细胞培养物中存在TGEV。

5.抗原性对来自美、英、日的10个菌株(包括猪传代和细胞培养的菌株)进行了交叉中和试验和空斑减少试验。证明TGEV只有一个血清型，且所有毒株间有密切的抗原关系。此外，TGEV与猫传染性腹膜炎病毒和犬冠状病毒具有抗原相关性。免疫扩散试验表明TGEV与血凝性脑脊髓炎病毒有交叉反应，但在空斑中和试验中未发现交叉反应。近年来，在开展了中国分离的“TGE”中国株和经猪传代的“TGE”冀株与米勒(M)株的交叉荧光抗体试验。已证实中国株与吉株一致，但与M株无交叉反应。1979年，黄俊健等人应用荧光抗体、中和试验、酶联免疫吸附试验和猪体交叉保护试验，发现中国株与M株、SH株、TO株不同。1981年，钱永清等人用比利时CLV(冠状病毒样)血清、中国株血清和M株血清制成的酶标抗体进行交叉染色，证明用中国株血清和比利时CLV血清制成的酶标抗体能染色中国株，而不能染色M株和SH株。但用M株血清制备的酶标抗体能染色M株和SH株，而不能染色中国株，证明中国株与比利时CLV在血清型上一致。1984年，宣化等通过猪胎儿肠上皮细胞单层培养成功分离出吉病毒株，并与中国株、四川株、M株进行交叉中和试验(细胞培养法)，证明吉株与中国株、四川株一致，但与M株不发生交叉中和反应，从而证明我国除猪传染性胃肠炎病毒外，还存在猪流行性腹泻病毒。

6.培养1956年，Lee报道TGEV可在猪肾细胞上连续传代28代，但无细胞病变效应。Harada，Japan (1963)报道TGE病毒SH株可对猪肾细胞产生细胞病变作用，随后又多次报道通过原代猪肾细胞培养分离出细胞病变的TGEV株。另据报道，TGEV可从猪睾丸细胞、猪甲状腺细胞、唾液腺细胞、狗肾细胞、猪食管、回肠、盲肠、结膜和鼻粘膜上皮中分离和传代。在第一代传代过程中，野生株引起的细胞病变效应可能是短暂的或轻微的，有时整个培养物中只出现几个小斑点，容易被忽略。用猪肾细胞盲传几代后，可见明显的细胞病变，如细胞肿胀，胞质内空泡形成，细胞变圆、皱缩、颗粒化，有的破碎解体，有的细胞从单层脱落形成网状。但即使延长培养时间，也不会破坏整个细胞单层。此外，一些菌株，即使盲传许多代，也不产生细胞病变效应。猪的甲状腺细胞、唾液腺细胞和睾丸细胞对TGEV敏感。Witte(1971)报道在26个样本中，有22个样本在猪甲状腺细胞培养中表现出不同程度的细胞病变效应，约25%的细胞单层被破坏，在第一代培养中可发现细胞病变效应。斯捷潘内克(1971)认为TGEV的细胞病变效应在原代猪唾液腺细胞中比在原代猪肾细胞中发展得更快。TGEV在细胞质中增殖，但不能在细胞核中增殖，不产生包涵体。低代细胞培养传代病毒对非特异性无病原体猪(SPF猪)死亡率高，并产生典型症状。病毒在高代(第125代)细胞培养中的致病性显著降低。TGEV在鸡胚和各种实验动物中不易生长。最近有报道说狗可以被实验感染，但需要进一步证实。

7.致病性TGEV在猪中引起该病，但其它动物如小鼠、豚鼠、仓鼠、兔、猫、狐狸、狗和椋鸟口服大量病毒后未发病，但口服病毒后可从猫、狗(7-14天)、狐狸(15天)和椋鸟(32小时)的粪便中回收病毒。1977年，三组猎犬报告了这种疾病在前东德的自然爆发。病犬表现出腹泻、呕吐、疲惫等症状。用它们的粪便喂养健康的小猪导致了这种疾病。的TGEV可使各年龄段的猪发病，5日龄以下仔猪死亡率可达100%。随着年龄的增长，死亡率逐渐降低。16日龄以上仔猪死亡率降至0% ~ 10%。TGEV在的靶器官是小肠。虽然病毒可存在于病猪的各种器官、体液和排泄物中，但以病猪空肠、十二指肠和肠系膜淋巴结中的病毒含量计算，病毒滴度可达106猪感染剂量/克组织。呼吸道感染后，病毒首先在鼻粘膜和肺部增殖，然后通过血液进入小肠。病毒也可通过口、咽、食管、胃直接进入小肠(猪传染性胃肠炎病毒可抗胃酸和胰酶)。小肠上皮细胞感染，空回肠绒毛明显萎缩，影响消化吸收。由于肠粘膜功能性上皮细胞的迅速破坏和脱落，产生某些酶的能力降低。病猪不能水解乳糖等营养物质。乳糖在肠腔内积聚，导致渗透压升高，水分潴留，甚至组织吸收液体，导致病猪严重腹泻和脱水。的潜伏期很短，通常为24-36小时，有时为12-18小时。病仔猪往往先呕吐，然后出现严重的水样腹泻，导致脱水死亡。3周龄以上的猪发病后通常可以恢复。猪的传染性胃肠炎经常发生在冬季和早春的寒冷月份。它经常会使整个猪群中所有或大多数易感的小猪生病。的主要病理变化为急性肠炎，伴有充血坏死，肠管扩张，充满液体，小肠壁变薄，空回肠纤毛明显萎缩，肠系膜淋巴管无乳糜。心脏和肾脏可以退化。

8.生态。十二指肠、空肠和回肠粘膜尤其是空肠的病毒检出率和病毒滴度。该病毒还能在鼻腔、气管、肺等呼吸道粘膜和扁桃体、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结等淋巴系统中增殖良好。TGEV随病猪和恢复期猪的粪便和鼻液排出。通过粪便排毒的持续时间约为8周。Underdahl(1975)通过鼻腔接种SPF猪。30 ~ 104天后，仍可从肺和小肠中分离到病毒，56%的猪可见明显的肺部病变。Kemeny等(1975)检查了与感染仔猪生活在一起的繁殖母猪的鼻液、乳汁和粪便，发现鼻液中有病毒检出率。以上事实表明，TGEV可通过消化道和呼吸道感染。康复猪感染时间长，病猪和康复猪都是主要传染源。狗、狐狸和椋鸟可以短时间携带毒素，这可能在传播疾病方面发挥作用。

9.免疫。许多国家对猪传染性胃肠炎的免疫做了大量的研究工作，其中大部分是以给哺乳仔猪提供乳免疫为主。使用的病毒产品包括强毒、灭活和减毒疫苗。妊娠母猪的接种方式包括口服、鼻腔、肌肉和乳腺接种。一般来说，分娩前20 ~ 40天，妊娠母猪口服强毒可产生良好的乳汁免疫，但有传播强毒的风险，使该病常见。应用免疫血清进行非口服接种，无被动保护作用，说明乳抗体可能存在于肠道内，对仔猪有免疫保护作用。近年来，已经通过细胞培养、传代和噬斑选择培养和测试了几种减毒菌株，并且正在实验室和田间进行测试。初步证明能为哺乳仔猪提供一定的乳免疫，但并不理想。目前，对怀孕猪接种疫苗的有效方法仍有不同意见。一般认为，母猪同时口服和鼻腔接种或乳房内接种能为哺乳仔猪提供更好的乳汁免疫。牛奶中的抗体包括IgG、IgA和IgM。IgA抗体主要是分泌型IgA，只有肠道受到抗原刺激时才会产生。哺乳期效价高，持续时间长，是乳汁免疫的主体。IgG抗体是非口服接种产生，在乳汁中迅速减少或消失，对乳汁免疫影响不大，只能起到一定的协同作用。关于IgA的形成机制，一般认为是病毒抗原刺激肠道淋巴小结，致敏淋巴细胞分裂增殖，产生淋巴母细胞，淋巴母细胞通过淋巴流和血流聚集在乳腺内，局部产生IgA抗体。的母乳免疫可以降低感染TGEV的仔猪的死亡率，但是一旦仔猪停止母乳喂养，它们可以再次被感染，因此它不能解决猪的免疫问题。近年来，各国都在研究该病的主动免疫，以期获得一种能快速产生免疫力的安全有效的减毒疫苗。日本减毒To163株对哺乳仔猪无致病性。用107 tcid 50/5ml口服接种To163株可使新生仔猪产生一定程度的自动免疫。但免疫效果受环境温度和初乳影响较大。根据实验结果，18 ~ 22饲养的猪在弱毒接种3 ~ 4天后会有免疫力，而31 ~ 34饲养的猪则完全没有免疫力。现场应用也受该地区温度的影响。温度越低，抗体效价越高。另外，在21 ~ 22饲养的猪接种减毒病毒时，初乳能抑制病毒在消化道的增殖。而35 ~ 36和10 ~ 11饲养的猪几乎不受初乳的影响。上述现象的机理还有待进一步研究。据报道，最近哈尔滨兽医研究所研制出猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻灭活疫苗，免疫效果良好。猪感染TGEV后，对某些疾病的抵抗力或免疫功能明显改变。Regulard(1965)报道，在TGE症状出现之前和之后，通过注射减毒疫苗通常不可能产生对猪瘟的有效免疫。

10.的诊断当不同日龄的猪在寒冷季节出现水样腹泻和呕吐时，两周内仔猪死亡率很高，疾病传播迅速，发病率很高，这是初步诊断的依据。但如上所述，猪轮状病毒和猪流行性腹泻病毒也可引起类似疾病，在流行病学和症状上很难区分。因此，我们必须依靠病毒分离和血清学试验才能做出最终诊断。

(1)病毒分离： 乳猪接种试验：取发病急、症状典型的病猪空肠(包括肠内容物)和肠系膜淋巴结，用缓冲盐水(或Hanks液)制成1 5 ~ 1 10悬液，2000r/min离心20min，取上清液加入青霉素和链霉素，使终浓度分别为1000U或mg/然后给2 ~ 3日龄健康乳猪2 ~ 4头口服。如果12 ~ 48小时后出现典型症状，结合流行病学可以确诊，但不能排除其他病毒的可能。细胞培养分离鉴定病毒：接种典型病猪或自然病猪的空肠和肠系膜淋巴结，用含0.5%水解乳清蛋白的缓冲盐水或Hanks液配制成1 5 ~ 1 10的悬液，分别加入青霉素和链霉素1000U或mg/ml。超声波处理后，以2000转/分钟进行离心沉淀20分钟。上清液用G6玻璃过滤器或滤膜(孔径0.2微米)过滤，滤液为接种物。传代猪的甲状腺细胞和唾液腺细胞敏感，原代培养可见轻微的细胞病变。原代猪肾细胞和猪睾丸细胞需要盲传几代才能看到细胞病变效应。传代细胞对新分离的病毒株不敏感。用常规方法培养的原代猪胎肾细胞。成年猪甲状腺细胞培养困难，应选用仔猪的新鲜甲状腺。服用后立即放入分别含青霉素和链霉素1000U或mg/ml的汉克斯溶液中，浸泡1小时，再用95%酒精浸泡，迅速取出，轻烧1 ~ 2次，使表面细菌完全杀灭。去除甲状腺包膜和表面组织。切开内部甲状腺组织，充分切成片(约1 mm)，用不含钙、镁的磷酸盐缓冲液或Hanks液洗涤3 ~ 4次，直至洗液清澈无油珠。加入0.25%胰蛋白酶，37预消化半小时，再用胰蛋白酶消化15小时。去除胰蛋白酶后，用Hanks液洗两次，加入营养液，反复吹，静置数分钟，收集小块细胞进行培养，37换液2 ~ 4天。第一种营养液是含20 ~ 30%小牛血清的05%乳清蛋白汉克斯液。第二种营养液(换液)是含10%小牛血清的MEM(或1640，199)和含05%乳清蛋白的汉克斯液的等份混合物，维持液含2%小牛血清。接种病材料前，用Hanks液洗涤单层细胞两次，按营养液的1/10 ~ 1/3加入接种材料。37吸附1 ~ 2小时后，倒掉或吸去多余的接种液，再加入pH为68 ~ 70的维持液，每日观察。一般会培养3 ~ 8天(培养8天需要换一次溶液)来收毒。如无细胞病变效应或细胞病变效应不明显，应连续传代培养3 ~ 7次。多次传代后，仍无细胞病变效应。为了证明细胞中是否存在TGEV增殖，可用TGEV荧光抗体染色法检查细胞培养物。或者用已知具有细胞致病作用的牛腹泻粘膜病病毒进行干扰试验。电子显微镜也可用于直接观察。如果细胞病变效应已经在发生，可以在细胞培养物上测量毒性，并且可以鉴定病毒。细胞培养病毒连续稀释10倍，每稀释1倍接种4个细胞培养管(瓶)。37孵育1小时后，加入维持液，继续37培养。TCID 50由Reed和Muench方法或其它方法计算。然后，进行中和试验。标准血清在56加热30分钟，然后连续稀释2或4倍，并加入等量的病毒悬液(约200 tcid 50/01ml)。将混合物在37孵育1小时，然后将每种混合物0 . 1ml接种到试管中的细胞培养物中。1.每次血清稀释少用两个试管。以中和50%病毒血清稀释度的试管为终点，其倒数为中和效价。

(2)血清学试验：血清学试验包括中和试验、荧光抗体试验、间接血凝试验、膨润土凝集试验、环沉淀试验和琼脂扩散试验。其中中和试验应用广泛，检出率和特异性较好，其次是荧光抗体试验。日本Shimizu等(1976)用纯化病毒对现场病例血清进行间接血凝反应，认为间接血凝值与中和抗体值高度一致，可作为快速诊断方法。其他方法与中和试验的符合率较低。中和试验是取发病时和痊愈后的血清，确定中和抗体价格是否上涨。如果痊愈后血清抗体价格上升，则为阳性。一般在感染后7 ~ 8天，最早在第4天，血清中就出现中和抗体，这种情况至少可持续18个月。中和试验的具体方法分为仔猪接种法和细胞培养法。自从成功培养TGEV的致细胞病变菌株以来，现在使用了许多细胞培养方法，包括致细胞病变抑制试验、微量染色试验、染色单层试验和蚀斑减少试验。使用用固定病毒稀释血清的一般方法。无论用什么方法，都需要几天时间才能完成测定。其中，蚀斑减少法更为敏感。荧光抗体试验也是实验室常用的方法。将感染猪的空肠制成冰冻切片，或刮取空肠绒毛上皮细胞制成涂片，低温丙酮固定30分钟，然后滴加TGEV荧光抗体，37染色30分钟，磷酸盐缓冲液冲洗15分钟，风干，滴加甘油缓冲盐水，盖玻片密封，荧光显微镜下检查。也可以应用间接荧光抗体技术。TGEV荧光仅在感染细胞的细胞质中发现。Pensaelt(1970)认为，腹泻早期荧光抗原明显，绒毛再生时检出率下降。感染后7天不能检测到荧光细胞。(3)电镜和免疫电镜观察：电镜观察：取TGE病猪粪10ml，用0.01 mol/l PH76 PBS以14稀释，高速离心，取一滴上清液置于铜网上。用2%磷钨酸负染后，在电镜下观察病毒颗粒。免疫电镜观察：取待检病毒滤液(抗原)2ml，加入150稀释的TGEV免疫血清8ml，于37水浴中浸泡1h，置于4冰箱中过夜。第二天，在7000g离心30分钟。向沉淀物中加入适量蒸馏水，重新悬浮，吸取一滴上清液，置于铜网上。用2%磷钨酸负染后，在电子显微镜下观察病毒颗粒的凝集。欧美多国发现猪呼吸道冠状病毒(PRCV)，应特别注意。PRCV主要在呼吸道生长和传播。被感染的猪有轻微或无临床症状，但SPF猪鼻接种荷兰分离株可引起致命性肺炎。PRCV和TGEV之间有很高的抗原相关性。除抗TGEV蛋白单克隆抗体外，抗TGEV抗体和大部分单克隆抗体均可与PRCV产生交叉中和反应，可用于病原和血清学试验中的鉴别诊断。