我国新发现猪丁型冠状病毒病

猪D型冠状病毒，又称猪冠状病毒（PDCoV），是一种新发现的冠状病毒，主要感染整个小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎并伴有腹泻和呕吐。 PDCoV 于2009-2010 年在中国香港首次报道。自2014 年初美国首次报告在猪群中爆发该病以来，至少有19 个州报告了这种新型冠状病毒。在美国，猪D 型冠状病毒感染的临床特征类似于猪流行性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE），但症状发作相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病可引起乳猪腹泻、呕吐，发病率和死亡率高达50%-100%。生长猪和成年猪感染后死亡率较低。现将本病例报告如下。

材料和方法

疾病

华南某集约化养猪场（2000头基础母猪）5头37日龄乳猪发生严重腹泻，传播迅速，发病率达90%，死亡率达90%以上。采集病猪的小肠，按1：5的比例磨碎制成病料，-80保存备用。

主要试剂

RNA提取试剂盒购自上海A公司，逆转录酶、RNase抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、凝胶回收试剂盒、DH5感受态细胞等购自TAKARA公司。

引物设计与合成

本实验室根据GenBank公布的序列号选择N基因，使用Primer Premier5.0设计了PDCoV、PEDV、TGEV、RTV（猪轮状病毒）4对引物，由B公司合成，预计扩增特异性基因片段大小为482 bp、450 bp、810 bp 和620 bp。

总RNA的提取

病材离心取上清液，按ANYGEN核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，溶于含RNase的水，-80保存。

RT-PCR检测

反转录体系：ddH2O 4 L，下游引物R 1 L，RNA 1 L，70水浴10 min，冰浴2 min； 5MLV buffer 2 L，ddH2O 1 L，dNTPs 0.5 L，RNase inhibitor 0.25 L，MLV reverse transcription Enzyme 0.25 L，42水浴1 h，72水浴15 min冰浴至冷却。 PCR系统：ddH2O 32.5 L，10MLV buffer 5 L，dNTPs 4 L，F 2 L，R 2 L，cDNA 4 L，rTaq 0.5 L。反应条件为945分钟，9430秒，5230秒，7230秒，30个循环，727分钟。 PCR反应产物在1.0%琼脂糖凝胶上电泳。

克隆

纯化回收后，将阳性PCR产物与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5感受态细胞。培养后挑取单菌落进行PCR鉴定，鉴定成功的重组质粒送B公司测序。

序列分析

将RT-PCR扩增的N基因进行克隆测序，用MEGA6软件进行处理，与GenBank上公布的PDCoV毒株的N基因序列进行比对（表1），绘制系统发育树。

结果与分析

病猪症状和病变

该集约化养猪场515日龄的乳猪腹泻严重，传播迅速，脱水迅速死亡，死亡率达90%以上。尸检病灶如图1、图2可见症状，主要在小肠，肠管明显扩张，充满黄色液体，肠壁变薄疏松，小肠粘膜充血，肠系膜呈索状充血。

4病毒N基因扩增

通过RT-PCR对样本进行PEDV/TGEV/RV/PDCoV检测，结果显示PEDV/TGEV/RTV未能扩增出目标条带，而PDCoV扩增出一个预期大小的片段，约482 bp，电泳见图3为图片。检测结果显示，病材PEDV/TGEV/RTV呈阴性，PDCoV呈强阳性，表明该猪场可能存在PDCoV感染。

PDCoV N 基因序列分析

从测序结果可以看出，Ch-A测序的N基因中间存在一个核苷酸缺失和数个突变。利用DNAstard软件，将测序正确的PDCoV N基因序列与GenBank上公布的国内外毒株N基因参考序列进行比对，结果表明，得到了PDCoV毒株N基因之间的核苷酸序列同源氨基酸序列同源性98.3%100%，氨基酸序列同源性95.0%100%；其中TX与国内已发表菌株的核苷酸同源性为98.3%99.0%，氨基酸同源性为95.0%95.0%。 96.9%，与香港株HKU15-155同源性最低；与韩国、美国菌株相比，核苷酸同源性为98.8%-99.0%，氨基酸同源性为96.2%96.9%（结果见图4、图5）。

PDCoV N基因遗传进化分析

利用MEGA 6.06软件绘制N基因系统发育树，结果表明，我国新型猪D型冠状病毒（Ch-A）与国内外报道的猪D型冠状病毒亲缘关系较远，且它独自在一个新的分支上。这说明这是我国新发现的一株新菌株（结果见图6）。

讨论

新出现的PEDV和PDCoV自2013年开始在美国蔓延，导致大量猪死亡。目前，国际上正在形成与该病毒相关的研究热点，也陆续发表了少量报道。但迄今为止，还没有中国猪场爆发和流行该病毒的报道。

我们首次报告在中国集约化养猪场爆发猪型冠状病毒病。通过设计4对冠状病毒引物，在检测PEDV、TGEV和RTV均为阴性后，进一步设计引物扩增PDCoV，呈强阳性。对PDCoV HN株的N基因进行测序，并与国内外已发表的序列进行系统发育树分析。结果表明，PDCoV毒株（Ch-A）与GenBank上公布的美国毒株和中国毒株不在同一分支。是一种新发现的新型冠状病毒病毒株。该分支的菌株是否与本病的高致病性有关值得进一步研究。该病毒是如何传入我国的，在我国各地的感染情况，目前还不得而知。

旧病未除，新病又生。要高度重视并立即加强对猪冠状病毒的监测和系统研究，减少对养猪业的损失和威胁。