影响免疫组化的因素及对策

一）免疫组化染色假阳性及其对策1、消除内源性酶的影响在涉及免疫过氧化物酶的各种染色中，过氧化物酶用于标记抗体。酶的作用是催化底物，使正常组织中也含有一定量的过氧化物酶，过氧化物酶也能催化底物显色，影响免疫组化染色的特异性。因此，在加入标记酶之前尽量将其灭活。活以保证染色反应的特异性。一般情况下，去除内源性酶的方法是先用3%的过氧化氢溶液作用，但在富含血细胞的标本中，由于血细胞中存在大量活性过氧化物酶，它们可以与氢气发生反应过氧化物产生强烈反应产生气泡并破坏组织结构和细胞形态。在OCT包埋的冰冻切片中，使用3%双氧水也会产生类似的现象。此时用3%过氧化氢甲醇溶液孵育20分钟即可灭活内源性酶。内源性酶的灭活对于正确判断含血细胞较多的标本，如骨髓、胎盘、脾脏等的染色结果非常重要。同样，正常细胞也含有生物素，尤其是在肝脏、脾脏和肾脏组织中。在使用亲和素试剂染色时，内源性生物素容易与二抗结合形成亲和素（或链霉亲和素）-生物素复合物，造成假阳性。消除这种非特异性染色的方法是在用生物素染色之前用亲和素饱和结合位点。 2. 抗体引起的非特异性染色高纯度、高效价的抗体是免疫组化染色的关键。以下情况可能会出现非特异性染色。 (1) 由于抗原不纯，制备的抗体不纯，这在多克隆抗体中很常见。亲和层析可用于去除非特异性抗体或使用高纯度抗原制备抗体，单克隆抗体可避免非特异性染色。 (2) 标本片含有与靶抗原相似的表位，唯一的解决办法是使用针对更特异表位的单克隆抗体。 3.消除非特异性背景染色非特异性染色最常见的情况是蛋白质（抗体）被吸附到组织切片中高电荷的胶原蛋白和结缔组织成分上。防止非特异性背景染色的方法之一是加入一抗在标本中加入不相关的蛋白溶液之前，将充电点堵住，一抗没有吸附的空间，从而保证一抗抗体不会吸附在胶原纤维和结缔组织成分上。最常用的无关蛋白溶液是来自与所用二抗相同动物的非免疫血清。使用与二抗相同的动物血清，避免二抗与预加蛋白结合造成的假阳性染色。用于阻断非特异性结合的血清不得出现任何溶血现象。红细胞破裂会导致其中的过氧化物酶与底物发生反应，导致非抗原特异性阳性染色。由于其复杂的成分，多克隆抗体更容易引起背景染色。稀释剂采用含1% BAS pH7.4的PBS，洗涤液中加入0.05%吐温20（Tween20）有助于消除背景染色。 4、消除病变色素的影响。当受检动物因出血等原因吞噬含铁血黄素细胞增多时，为防止与DAB呈现的黄褐色相混淆，最好使用AEC显色剂。当组织固定时间过长时，切片中容易出现福尔马林色素颗粒，影响结果的观察。采集样品时，应用流水充分冲洗，以消除影响。 5. 切片制备不当引起的非特异性染色非特异性染色常发生在严重变性、坏死和炎性病变、胶原纤维和结缔组织、切片不平整、皱纹和组织边缘处。有的是由于组织电荷状态发生变化而吸附抗体引起的；一些机制未知；有些可能与组织边缘或褶皱深处的凹槽配置有关。正常血清（5%~10%）用于阻断和饱和电荷吸附位点，改进取样和生产技术。 6、清洗不彻底造成的非特异性着色要严格操作。缓冲液中含有一定量的盐分，有利于降低背景着色。通常使用0.05mlo/LPBS，溶液中加入Tween 20效果更佳。 对于特殊标记，试剂公司一般会提供缓冲液配方。此外，切片在洗涤后和加入下一个试剂之前不能干燥，因为干燥的切片上会出现非特异性着色。 7、对于一些DBA显色产生的底色，在使用浓缩型DAB试剂盒时，请严格按照说明书中注明的滴加顺序，注意校正蒸馏水的pH值，以保证实验结果的正确性。粉末DBA溶解时，常有一些不溶性颗粒，必须通过过滤除去。否则它可能会沉积在切片组织上，导致染色斑驳。另外，DAB储存不当产生的氧化物也会沉积在切片上，所以要将DAB储存在干燥避光处，用后立即配制，使用前加入H2O2。 （二）免疫组化染色的假阴性及对策假阴性通常是由标本抗原保存、试剂质量、染色操作等因素造成的。 1. 组织处理不当、固定延迟或固定时间过长常导致抗原丢失。浸蜡温度过高、时间过长，会破坏抗原的抗原性。改善技术条件，重新取材。 2. 抗原修复由于目前常规进行的石蜡切片标本都是用甲醛固定的，形成的醛键、羧甲基键等阻断了一些抗原决定簇，或者由于蛋白质之间的交换联而使抗原决定簇隐蔽，因此在染色时，有些抗原需要先进行抗原修复或暴露。至于哪种抗原需要进行修复，需在建立染色程序时经实验确定。抗原修复分为化学方法和物理 / 化学方法。 　　（ 1 ）化学方法：主要是通过一些酶的作用，使抗原决定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶、尿素、皂素等。需根据需要使用。 　　（ 2 ）物理 / 化学方法：主要有以下几种 　　① 单纯加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，加热至沸腾，并持续 10~15 分钟，此方法操作简单、经济，适用于所有实验室，但对封闭牢固的抗原决定簇暴露不理想。 　　② 高压加热方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的高压锅中，加热至喷气，并持续 1~2 分钟。 　　③ 微波方法：将片子放入装有柠檬酸盐缓冲液的容器中，置微波炉加热至 95 ℃以上，并持续 10~15 分钟，室温 20~30 分钟自然晾凉，使蛋白复性。此方法不仅利用热效应，且可通过微波的直接作用，打开蛋白之间的交联键，将已被封闭的抗原决定簇暴露和修复。 　　3 、 一抗的选用、稀释度及孵育时间 第一抗体是免疫组化染色中最重要的试剂。应用何种一抗，应根据具体目的和要求决定。临床病原诊断，要求较高的敏感性和较广的识别谱时，可选用多克隆抗体或几株混合的单克隆抗体，来避免抗体反应谱过窄造成的假阴性。某些研究工作需要检测单一抗原决定簇的存在，此时必须选用单克隆抗体。一抗的参考稀释度常由 “方格滴定”和相关检测结果推测得出，但因实验条件不同，对抗原活性的影响不同，最佳稀释度仍需经过摸索。任何一个抗体，其工作稀释度取决于如下因素： 　　（ 1 ）抗体的滴度即特异性抗体浓度； 　　（ 2 ）抗体的纯度，即抗体中杂蛋白的浓度。杂蛋白较高时，需要较高的稀释度； 　　（ 3 ）孵育的时间，时间越长，所用的抗体稀释倍数越高； 　　（ 4 ）组织中抗原含量对抗体的应用浓度有不同的要求。在免疫反应中，过多的抗体将导致阴性结果，这种现象类似于凝集反应中的前带现象。因此需用“方格滴定”的方法找出适当的稀释度，并得到最大强度的抗原染色和最低的背景着色。一般认为，某一稀释度下特异性染色较强且无背景着色，是较理想的稀释度，加长孵育时间可有效地降低所用抗体的浓度，有利于提高染色质量，节省抗体，可用 37 ℃ 0.5h 或 4 ℃过夜的方法。只要控制好温度、抗体稀释度和孵育时间，一般都能得到理想的染色效果。 　　4 、 选择适宜的二抗 二抗应用中常出现的总是是抗体本身与一抗不匹配，如抗兔的二抗，匹配鼠来源的一抗；或以抗鼠的二抗匹配兔来源的一抗，都会出现假阴性结果。 　　5 、 试剂造成的影响 酶的活性降低，缓冲液内加有叠氮钠抑制了酶活性，底物中所加 H 2O2 量少或失效，操作中漏加了某种试剂等，都会造成假阴性结果。如阳性对照不成立，则需认真检查操作程序，查找可能的原因。