猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学研究进展

摘要：猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）是一种严重危害养猪业的病原体'target='_blank' href='http://cj.我要创富网/jinrijujiao/'养猪业，论文概述了PRRSV的生物学特性综述了PRRSV新疫苗、反向遗传技术和分子诊断的研究进展，为PRRS病毒的预防和诊断提供科学依据。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；新疫苗；反向基因技术；分子诊断

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称猪蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的疾病。特征性传染病。自1987年在美国首次发现以来，相继在各国流行传染，给世界养猪业造成严重的经济损失，并被列为国家必须报告的动物疫病。世界动物卫生组织(OIE)。 II类动物疫病。 1991年Wensvoort等首次分离出该病毒，并在第10届国际病毒大会上将该病毒归入新成立的Arteriviridae和Arterivirus属。根据PRRSV基因组成和结构蛋白抗原特征的明显差异，PRRSV可分为以LV株为代表的欧洲型和以ATCC VR2332株为代表的美洲型。两株氨基酸同源性为78%-81%。 1996年，郭宝清等首次报道从流产胎儿中分离出PRRSV，证实我国也存在猪繁殖与呼吸综合征。 2006年以来，我国又爆发了美洲型变异型高致病性PRRS疫情，给我国养猪业造成了巨大的经济损失[12]。近年来，越南、老郭、缅甸等周边国家也相继爆发蓝耳病。

1 PRRSV的生物学特性

PRRSV 是一种带有包膜的单链正义RNA 病毒。病毒颗粒直径为4565nm，核衣壳为2535nm。表面有明显的长约5nm的细丝。核衣壳是立体对称的20面体。 PRRSV 对温度和湿度敏感。潮湿的环境有利于PRRSV的生存。它可以在低温下长期存活，但在干燥条件下病毒的传染性会迅速失活。 PRRSV 对pH 变化敏感，在pH 6.5 和7.5 之间相对稳定。超出这个范围，其传染性可降低90%以上。 PRRSV不具有凝集红细胞的特性，但经非离子洗涤剂和脂类溶剂处理后可凝集小鼠红细胞。病毒在蔗糖和氯化铯中的漂浮密度分别为1.13 g/cm31.19 g/cm3和1.18 g/cm31.23 g/cm3。在猪中，该病毒对单核巨噬细胞系统具有趋向性，尤其是猪肺泡巨噬细胞（PAM）；在体外，该病毒可在Marc145、MA104和CL2621等多种细胞系上增殖，所产生的病变一般不明显，但高致病性PRRS病毒株在适应Marc145细胞13年后可产生明显的细胞病变。几代人。 PRRSV具有抗体依赖性增强作用（antibody dependent enhancement, ADE）。当病毒与抗体结合产生抗原抗体复合物时，Ab的Fc片段与靶细胞的Fc受体结合，从而促进病毒进入细胞。因此，在细胞培养物中加入一定滴度的PRRSV抗体，可显着提高病毒含量。 PRRSV 可通过胎盘感染胎儿，导致流产和木乃伊化。此外，PRRSV可引起猪的持续感染。

2 病毒基因组结构及编码蛋白

2.1 病毒的遗传结构

PRRSV 是一种非分段的正义单链RNA 病毒。基因组长约15 kb，基本结构为5'帽结构非编码区ORF1aORF1bORF(27)非编码区poly(A)3'。帽结构有助于维持病毒基因组的稳定性，并防止其被核酸酶降解。 5'非编码区（noncoding region，NCR）长约190nt，高度保守，在两种血清型菌株中同源性可达99%。病毒基因组的相邻编码框架部分重叠。 ORF1，包括ORF1a和ORF1b，全长约12 kb，占基因组的80%，编码病毒RNA依赖性RNA聚合酶。编码框架ORF2-ORF7编码病毒结构蛋白，其中ORF2-ORF6编码病毒膜相关蛋白，ORF7编码病毒核衣壳蛋白。 ORF7 终止密码子后跟一个包含poly(A) 尾巴的3' 非编码区。康泽尔曼等人。据报道，LV 菌株的3' 非编码区为114 nt。马尔达西等。报道3'非编码区为151nt，其中欧洲株（LV）的3'端非编码区比美国株少37nt，两者同源性为59 %。这种差异可用于PRRSV 的分子鉴定。诊断和病毒分型。值得指出的是，在高致病性PRRS病毒基因组中，非结构蛋白Nsp2基因的1 447-1 449位

2.2　结构蛋白

GP2由ORF2编码，分子质量约为30 ku。GP2为糖蛋白，有两个明显的疏水峰和糖基化位点，肽链内含有二硫键，通过二硫键和其他结构蛋白可形成同源或异源多聚体，其糖基化位点覆盖有N­聚糖复合物。GP2蛋白表面有一个抗原位点，其周围有一个与GP5蛋白B细胞抗原位点构成一级结构的VSRRIYQ基元。GP2蛋白免疫原性差，在病毒中含量较少，很难从感染的细胞裂解液或纯化的病毒粒子中进行分离鉴定[4]。

GP3由ORF3编码，其分子质量约为45 ku，含有265个氨基酸，有7个N­糖基化位点，但是否为病毒的结构蛋白还有争议。GP3是PRRSV各毒株间保守性较差的蛋白之一，美洲型与欧洲型ORF3编码的氨基酸同源性低于55%，其功能可能与诱导细胞免疫有关。

ORF4编码GP4，其分子质量大约为19 ku～20 ku，能诱导产生中和抗体。是组成病毒粒子的次要囊膜蛋白，通过共价键与GP3和GP2形成异源三聚体，并以异源多聚体的形式组装进PRRSV颗粒，它们对形成感染性病毒颗粒是必要的，不表达GP2， GP3或GP4蛋白的基因敲除载体仍然能够组装成病毒粒子，但不具感染性[5]。

ORF5编码的糖基化囊膜蛋白GP5，又称E蛋白，含有4 个糖基化位点。分子质量为22.4 ku，有6个抗原决定簇，是诱导产生中和抗体的主要结构蛋白，病毒中和作用与抗GP5抗体效价呈显著相关性；GP5还可诱导细胞凋亡。GP5是PRRSV结构蛋白中变异最大的蛋白，同型毒株GP5氨基酸的同源性在88%～99%之间。而欧、美型毒株GP5氨基酸的同源性仅在52%～55%之间。loemba H D等研究表明，E蛋白抗体比其他蛋白抗体产生得早，接种后7 d即可检测到。

ORF6编码膜基质蛋白又称M蛋白，分子质量为19 ku。M蛋白能刺激T淋巴细胞的增生，诱导产生的抗体具有中和作用。M蛋白是PRRSV中最保守的蛋白，欧、美型毒株间M蛋白氨基酸序列同源性在78%～81%，而同型毒株M蛋白氨基酸的同源性大于96%。M蛋白可能在维持病毒形态、病毒组装和出芽中发挥作用。

ORF7编码核衣壳蛋白又称N蛋白，分子质量约为15 ku。N蛋白至少有5个抗原决定簇，其中包括两型的共同决定簇和特异性决定簇，具有一个糖基化位点，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在维持蛋白构象上起重要作用。其N端半段是由Arg、Lys和His 3种碱性氨基酸组成，这是两种血清型毒株所共有的特点，它们可能和RNA基因组间的相互作用有关。蛋白之间以二硫键形成同源二聚体。N蛋白的保守性较好，在病毒粒子中含量可达20%～40%，免疫原性强。感染PRRSV后约10 d可产生该蛋白抗体，产生的抗体无中和活性。通过对其抗体的检测可进行诊断，基于重组N蛋白的ELISA已应用到PRRS诊断与流行病学调查中[6]。

3　PRRSV的新型疫苗研究

近年正在研制的PRRS的新型疫苗主要有基因疫苗和活载体疫苗。由于GP5含有病毒的中和位点，因此大多数PRRS新型疫苗都是以GP5为靶抗原研制的。

3.1　基因疫苗

Lowe J F 等[7]用含编码ORF5的质粒进行DNA免疫，可使接种猪产生抗ORF5的特异性中和抗体，接种猪免于强毒攻击造成的全身性病毒血症和肺部病变，并使间质性肺炎和支气管肺泡炎明显减轻。Xue Q等[8]用编码PRRSV ORF5、ORF7和编码猪细胞因子IL­2、IFN­γ的真核表达质粒联合接种仔猪，诱导出高水平的体液免疫和细胞免疫反应，免疫猪能抵抗PRRS强毒的攻击。另外，Fang L 等[9]将T细胞表位插入ORF5构建DNA疫苗免疫小鼠，检测到抗GP5抗体和T细胞的增殖，提高了GP5的免疫原性。江云波等[10]分别以PRRSV ORF5m(修饰型ORF5 基因)及ORF6 为候选基因，分别构建了单基因及双基因共表达的真核表达质粒pCI­0RF5m、pCI­ORF6 及pCI­0RF5m/ORF6。将构建的表达质粒免疫小鼠，接种后6周试验组小鼠出现血清中和抗体，8 周时最高可达到1∶32，同时还可检测到特异性细胞免疫应答，pCI­0RF5m/ORF6的免疫效果明显高于单独表达ORF5m 基因的pCI­ORF5m 组。进一步将DNA疫苗免疫断奶仔猪，pCI­0RF5m/ORF6 免疫组同样能诱发优于pCI­0RF5m 免疫组的中和抗体和细胞免疫反应。结果表明，采用ORF5m 和ORF6 双基因共表达策略能够显著提高PRRSV DNA 疫苗效力。

3.2　活载体疫苗

Qiu H J等[11]以PRVBartha­K61 株为载体，构建表达PRRSV主要免疫原性蛋白GP5的重组伪狂犬病病毒疫苗，免疫仔猪后可以对PRRSV强毒攻击产生有效保护。Gagnon C A等[12]用复制缺陷型人5型腺病毒(replication­defective adenovirus，rAd)载体表达GP5 基因免疫猪后再攻毒，免疫猪产生了针对PRRSV的免疫记忆反应。Alonso S 等[13]利用传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)辅助表达系统，构建了表达PRRSV ORF5的质粒M39­ORF5，将M39­ORF5与TGEV辅助病毒一起免疫7日龄仔猪，采用滴鼻、口服和胃肠道三种途径联合免疫，共免疫3次，间隔7 d，在第3次免疫后7 d采血，采用GP5多肽检测抗体，免疫猪产生了很高的ELISA抗体，但该试验未检测中和抗体。Bastos R G 等[14]用卡介苗(BCG)表达缺失GP5 N端30 个氨基酸的重组体(rBCGGP5)及M蛋白重组体(rBCGM)免疫猪，接种30 d后，重组卡介苗免疫组产生了特异性的体液免疫反应，接种60 d后检测到中和抗体，接种67 d后可检测到抗卡介苗抗原的IFN­γ反应，攻毒试验表明，免疫猪可得到部分保护。Jiang W 等[15]用 rAd­GP5、rAd­M和rAd­M­GP5分别免疫小鼠，结果显示表达的M­GP5融合蛋白对研制PRRSV疫苗最有潜力。Shen G 等[16] 以禽痘病毒(Fowlpox virus)为载体分别得到了能表达ORF5­ORF3和IL­18­ORF5­ORF3的活载体rFPV­ORF5­ORF3 和rFPV­IL­18­ORF5­ORF3，对猪初免后21 d加强免疫，60 d后进行攻毒，免疫组的病毒血症和支气管淋巴结的病毒含量均低于对照组，免疫猪可得到部分保护。

4　PRRSV的反向遗传学研究

1998年，Meulenberg等获得了PRRSV欧洲型代表株­LV株的感染性cDNA克隆。2003年，美洲型代表株(VR­2332)的感染性克隆也宣告成功[17]，这是PRRSV 研究过程中的又一重大进展。借助反向遗传学操作技术对PRRSV主要进行以下几方面的研究。

4.1　研究基因功能

Verheije M H等[18]借助PRRSV感染性cDNA克隆，以研究病毒基因组的结构蛋白编码区是否存在病毒复制所必需的结构。通过缺失分析，证实编码核衣壳蛋白的ORF7中的34个核苷酸(14 653至14 686)是RNA复制所必需的，这34个核苷酸在所有的PRRSV分离株中高度保守，推测它能形成发夹结构。该发夹结构的弯曲部分的7个核苷酸，可能与PRRSV 3′端的非编码区内发夹结构的弯曲部分完全匹配，形成了紧密的互作。突变分析证实这一紧密互作是病毒RNA复制所必需的。孙志等[19]在构建北美株PRRSV感染性克隆pCBC2的基础上，将3′UTR中的一级结构进行了系列缺失或插入突变，并改变二级结构中的一个保守的茎环结构，构建全长PRRSV 突变体克隆，结果表明PRRSV 3′UTR的5′端可耐受41个核苷酸的缺失与23个核苷酸插入，但进一步缺失9个核苷酸则造成保守的环结构突变，病毒失去了感染性。证明了这是3′UTR 中控制PRRSV 复制过程的必需序列及二级结构，为进一步研究病毒复制调控元件奠定了基础。

4.2　构建嵌合病毒研究基因变异与毒力之间的关系

Dobbe 等利用EAV感染性克隆，将GP5和膜蛋白M的胞外域编码序列，替换为其他相应的相关或非相关RNA病毒的对应序列。通过免疫荧光显微镜能观察到GP5和M蛋白复合体被运送到高尔基体，这有赖于它们之间形成的异二聚体，这一过程是病毒装配的前提条件。在所有嵌合病毒中，只有含PRRSV 或LDV 胞外域的嵌合病毒被致弱了，但还能存活，且依然能感染BHK­21 细胞和兔肾(RK­13)细胞，而PRRSV和LDV却不能感染这些细胞。这说明GP5 的胞外域并不像以前猜测的那样参与受体识别，也不是EAV细胞嗜性的主要决定因素。Wang Y 等[20]将疫苗毒MLV和强毒株MN184的5′UTR/ORF1进行互换， 分别构建了pMLVORF1/MN184和pMN184ORF1/MLV 感染性克隆，体外转录分别得到嵌合病毒rMLV和rMN184，本动物试验表明，MLV的5′UTR/ORF1 及ORF2­7/3′UTR可用于强毒致弱，为PRRSV疫苗的研究奠定了基础。

4.3　在研究新型疫苗上的应用

Verheije M H 等[21]为获得PRRSV 减毒活疫苗，利用LV株的感染性cDNA克隆，在病毒基因组3′端引入了一系列的缺失。将这些缺失后的全长克隆体外转录后转染BHK­21细胞，细胞培养上清再接种PPAM以检测是否有病毒增殖。结果发现ORF7 编码的核衣壳蛋白C端最多可缺失6个氨基酸而不影响感染性病毒的产生。更进一步的缺失则既不能产生病毒，也得不到包含病毒RNA的病毒样颗粒。3' UTR区紧邻ORF7 区域的缺失分析表明，去除ORF7终止密码子后面的7个核苷酸后，依然能得到感染性的病毒。缺失这一区域的32个核苷酸则完全终止了RNA的复制，从而阻止了感染性病毒的形成。将缺失突变体在PPAM上传代，证实了突变位点的遗传稳定性。此外，这些缺失并未影响重组病毒的体外生长特性，它们的抗原性与野生型病毒相似。缺失N蛋白6个残基突变体的免疫沉淀分析证实截短的蛋白确实较野生型N 蛋白更小。该研究所得到的缺失突变体是很有意义的PRRSV候选疫苗株。

4.4　发展病毒载体的研究

Verheije M H 等[22]通过在LV株感染性cDNA克隆中插入外源抗原编码序列，首次验证了PRRSV 作为病毒载体的可能性。将人A型流感病毒血凝素(HN)蛋白的一个表位引入LV 的5′端和3′端，分别得到了HA表位和N 蛋白的融合蛋白。此外，5′端含HA表位的重组子，还在HA和ORF7之间另加了一个口蹄疫病毒自剪切蛋白酶2A的编码区，并使它们处于同一读码框内，以确保从杂合的前体中产生有功能的N蛋白。当全长cDNA克隆体外转录出的RNA转染BHK­21细胞后，两个重组子都能复制，能表达HA表位，并能产生子代病毒。然而，将HA 表位直接融合到N蛋白的N端或C端，都影响了重组病毒的存活及其遗传稳定性。重组病毒在PPAM上传代，证实部分病毒在第4代丢失了HA表位。相比之下，以前体切割形式表达HA表位的重组病毒，在第4代时HA表位依然存在。这些病毒的生存都未受到影响。免疫沉淀和脉冲示踪试验表明，2A蛋白酶将HA表位从N蛋白中共转录切割。他们的结果证实了利用PRRSV 作为病毒载体的可行性，即PRRSV也能将其他病原体的抗原传递给猪的免疫系统。

5　PRRSV的分子生物学诊断

建立有效实用的诊断技术是防控PRRS流行的重要环节，目前，对PRRSV的分子生物学诊断技术主要是RT­PCR，它是一种良好的可替代细胞培养检测PRRSV的方法，Suarez等初步建立了RT­PCR技术并应用到疾病检测中。Christopher等建立了检测猪精液中PRRSV的RT­PCR方法，该方法快速、敏感、可靠，试验接毒92 d后，仍可从猪的精液中检测出病毒RNA。Kono等用套式RT­PCR，即设计一对共同引物和两对特异性引物，提取病毒RNA后，先用共同引物进行RT­PCR扩增，再分别用两对特异性引物进行PCR，结果显示比常规PCR在敏感性上提高了100倍。Inoue R等[23]将FTA(Flinders technology associates filter papers)卡与实时定量PCR技术相结合应用于检测猪血病毒，该法不需提取病毒RAN即可进行PCR，缩短了时间，简化了操作程序。Egli C等[24]建立了定量TaqMan RT­PCR方法来检测PRRSV，通过与其他检测方法比较，发现在可操作性、敏感性及特异性上都具有一定的优越性，而且能区分不同的毒株。但该法需要合成特定的探针，价格昂贵。Martínez E 等[25]建立了SYBR Green 荧光定量PCR，样品病毒含量少至0.03TCID50仍可检测出，试验接毒2 d后从猪血清中即可检测到病毒，具有很高的敏感性，另外，该法还能对欧洲株和美洲株进行分型。与荧光探针法(TaqMan)相比，荧光染料SYBR Green法价格更便宜，适用于大量临床样品的检测。

6　展望

PRRSV的分子生物学研究虽然取得了很大的进展，但人们对该病毒的致病机理、持续感染机制、免疫机制及一些病毒编码蛋白的结构与功能关系尚不十分清楚。如何阐明这些机理将是今后对PRRSV 的重点研究方向，随着对PRRSV分子生物学研究的不断深入，这些问题将逐渐得到解决，借此人们将研究出更加有效的预防和控制PRRS的措施。