PLA2对红细胞形状的影响

（一）循环化

1、体外红细胞形态的改变用体外间接溶血的蛇毒处理正常人红细胞。虽然没有发生溶血，但红细胞的形状发生了很大的变化，由原来的扁平状变成了球状。早在1883年Mitcheu等人就描述了这种现象，后来许多学者也作了类似的报道。 Bergenhern（1936）对这一现象进行了详细研究，认为这种细胞形态的变化是由溶血卵磷脂引起的，溶血卵磷脂是由有毒的PLA2水解血浆卵磷脂产生的。他认为这种形态变化是溶血的前期。吉特等人。 (1959) 用V. nae 蛇毒做红细胞形态改造实验。结果表明，在1ml血液中加入5pg毒物，可使红细胞瞬间变圆，红细胞沉降受到抑制。如果用洗过的红血球代替，加入毒液不会发生形态变化。已经被蛇毒打成圆形的红细胞，用普通血浆或白蛋白溶液洗涤可以恢复原状，但用生理盐水洗涤不能恢复原状。变圆的红细胞的通透性和机械脆性增加，即使恢复到双盘结构，其通透性和脆性也高于正常红细胞。 Balozet (1962) 研究了多种蛇毒。除了白唇曼巴蛇毒外，其他蛇毒都可以改变血液中红细胞的形态，但不同的蛇毒有不同的作用。由于红细胞形态的改变是由PLA2作用产生的，因此除蛇毒外的所有蛇毒均含有PLA2o

Bergenhem（1936）认为红细胞变圆是溶血的初始过程。虽然当时有很多反对意见，但最终还是澄清了。 Avi-Dor (1960) 使用一种有效的方法来测量形态变化，证明了使细胞变圆的因素确实是血浆磷脂PLA2、溶血卵磷脂和脂肪酸作用的产物。溶血卵磷脂和脂肪酸对红细胞的作用非常快，红细胞变圆的快慢反映了这种因子产生的快慢。为什么正常血液中的红细胞会保持圆形状态而不溶血？对这个问题的解释是血浆中磷脂的量有限，所以产生的溶血卵磷脂比较少，不足以产生溶血作用；另一个原因是有血浆蛋白起保护作用。 Avi-Dor 等人。 (1960) 确定了蛇毒与人血浆红细胞相互作用产生的溶血卵磷脂。

定量分析发现，结合在红细胞膜上的溶血卵磷脂的数量与红细胞的形态有关。当溶血卵磷脂结合在每个红细胞膜上时，红细胞变成缩小的红细胞；当1.3X10_n结合在每个红细胞膜上时，形成缩小的圆形红细胞；高于2X11-11时，形成光滑圆形红细胞。在正常人体血液中，溶血卵磷脂的产生量不会超标，这个量低于溶血所需的量，所以一般不会引起溶血。值得注意的是，人体血液中只有约20%的溶血卵磷脂吸附在细胞膜上，其余与血浆蛋白结合。用白蛋白洗涤经蛇毒处理过的红细胞，可使红细胞恢复形状，因为吸附在红细胞膜上的溶血卵磷脂被洗掉了。

脂肪酸是卵磷脂的水解产物之一，还能改变红细胞的形态，抑制红细胞的沉积。现在的问题是，引起细胞形状变化的因素是脂肪酸还是溶血卵磷脂。 DevrieS（1960）发现，用肝素处理后，血红细胞形状的改变是由于脂肪酸吸附到细胞膜上引起的。这种动物的血液含有脂蛋白酶，脂肪酸是从甘油三酯中水解而来的。然而，单独由脂肪酸引起红细胞形状改变所需的脂肪酸量远大于溶血磷脂酰胆碱和脂肪酸联合作用所需的脂肪酸量。

Sheetz 和Singer (1974) 研究了各种试剂引起红细胞形状变化的机制。他们认为，各种物质与外膜结合，而内膜保持原来的体积和面积。这种不平衡导致膜上升。皱纹。脂肪酸和其他带负电荷的两性化合物（如2,4-二硝基苯酚、巴比妥酸盐）和不带负电荷的溶血卵磷脂会导致细胞膜起皱。进一步假设只有与膜结合的扩散性较低的两性化合物才会导致膜起皱，因为更大的扩散会使内层处于相同的浓度并且无效。另一方面，一些阳离子两性化合物如吩噻嗪镇静剂和局部麻醉剂能够穿过外部脂质并与内部脂质结合，可能与磷脂酰丝氨酸结合，从而由于内部脂质的膨胀而使细胞呈杯状。不管是缩水还是拔罐，浓度过高都会引起溶血。

2. 体内红细胞形态的改变不仅红细胞在体外可以发生形态改变，体内的红细胞也可以发生类似的现象。 Bal0Zet（1962）将蛇毒注射到家鸽体内，发现只有在高浓度时才会发生形态变化。达农等。 (1961) 证明，将低于致死剂量的nM 蛇毒注射到兔子或小鼠体内时，红细胞的形状发生了变化。注射量越大，红细胞形态变化越快。当注射低于致死剂量的V.蛇毒时，变形的红细胞逐渐恢复形状，且无血影红细胞，表明未发生溶血。 Klibansky (1962) 从Bian'« 中提取这种蛇毒

将获得的PLA2 注射到家兔体内，红细胞的形态迅速发生变化。注射后2小时内，血中溶血卵磷脂含量达到正常值，红细胞也恢复正常。 PLA2只能引起极少量动物溶血，表现为红细胞寿命缩短，血红蛋白含量降低，红细胞计数和血细胞比容下降，网织红细胞增生与蛇毒相似。沸水浴处理毒蛇毒

最终样品包含PLA2。将此样本注射到狗体内会导致红细胞变形。这时，溶血卵磷脂吸附在红细胞膜上。这种变形不引起或很少引起溶血。如果与样品同时注入其他几种毒液促凝血剂，则可诱发溶血。

以上实验可归纳为：磷脂酶可引起体内红细胞形态的改变，但溶血不一定随之发生。溶血的发生由以下因素决定：首先是溶血卵磷脂吸附在红细胞膜上的量和维持时间，它由血浆中卵磷脂的初始浓度和血浆溶血卵磷脂的浓度决定清除率决心，决意，决定；二是血浆中能保护球形红细胞不溶血的蛋白质浓度；三是脾

(二）溶血卵磷脂和脂肪酸的溶血作用

溶血卵磷脂的溶血作用是由于其与红细胞膜上的胆留醇形成复合物或取代胆留醇引 起的。Klibansky等发现，随着溶血卵磷脂吸附到红细胞膜上量的增加，红细胞胆甾醇的 含量有稍微的减少。Zaki(1969)认为溶血卵磷脂引起红细胞膜上胆留醇减少是引起溶血 作用的本质。用沙漠眼镜蛇蛇毒做试验，发现在血衆存在下小鼠 红细胞发生溶血，同时膜胆留醇的含量也下降，这种蛇毒没有直接溶血活性。如用上述蛇 毒对小鼠进行体内实验，尽管血浆内的卵磷脂转化为溶血卵磷脂，但没有溶血作用发生， 也没有发现血浆胆留醇的浓度增加。如用相同的剂量注射到切除肾上腺的动物体内，血浆 胆甾醇浓度增加且发生溶血。如果先注射促肾上腺皮质激素，则上述现象又可被抑制，因 此，认为肾上腺皮质激素可以阻止由蛇毒产生的溶血卵磷脂的溶血作用。对上述实验结果 还有不同的看法。

Reman(1969)发现，一个溶血剂量的溶血卵磷脂不能使细胞膜胆留醇降低到足以发 生溶血的地步。Lucy等(1970)对溶血卵磷脂的溶血机制有不同看法，他认为溶血卵磷脂 通过把稳定的双脂层变成不稳定的微细胞结构而引起溶血。

(三）血清蛋白对溶血作用的影响

有关血清蛋白对溶血作用的影响前面已多次提到，它的作用因不同的溶血系统而各 不相同，下面分别说明它们的作用。

在间接溶血系统中，反应液含有经洗涤的红细胞，间接溶血蛇毒或pla2以及外源的 磷脂。在这种系统中，白蛋白可以和pla2水解所产生溶血物结合而起到保护红细胞的作 用。Luzzio等(1967)发现CroteZw类蛇毒对人和家兔红细胞的溶血作用(在卵黄存在下） 被血清白蛋白抑制，而a、p、y-球蛋白不能起这种作用。

在有经洗涤的红细胞、蛇毒pla2而没有外源磷脂的存在下，白蛋白可以加强溶血作 用，它是通过去掉红细胞外膜中被水解的产物溶血卵磷脂和脂肪酸而起作用的。Gul和 Smith(1974)证明白蛋白在除去膜上脂肪酸低于75%时还不会引起溶血,但如继续除去 脂肪酸就会使血红蛋白从红细胞中逸出。由于白蛋白在有效浓度情况下既可以与膜上的脂肪酸结合，也可以和膜上的溶血卵磷脂结合，现在还不知道引起溶血的真正原因。尽管 保温前或保温后加白蛋白都可以加强溶血作用，但如果加白蛋白后保温一段时间再加 PLA2，则可以减少溶血量，这种保护作用可能因为细胞膜上覆盖了白蛋白而使膜稳定，因 此对细胞膜磷脂的降解作用降低。

五、由Cobra因子(CVF)引起的溶血

除了由PLA2 和DLF引起的溶血途径外，Cobra因子(CVF)也可以通过作用于补体 系统而引起溶血。

蛇毒在鸽血清的存在下可以引起羊红细胞的溶血，如果把鸽血清在56°C条件 下保温30min则溶血作用就不再发生，在这种情况下鸽血清中的磷脂未受影响。以后有 学者发现缺乏补体的血清不能有效地促进溶血作用的发生，这说明该溶血作用和补体有 关，那些可以使C3失活的物质可以抑制这种溶血作用。这种依赖补体的溶血作用最初认 为是由C06ra蛇毒中PLA2水解血清磷酯产生的溶血磷脂引起，但这种观点与血清在 56°C保温后失去溶血活性不相符合，而且等定量地测定了溶血卵磷脂的量，发现 不足以引起溶血。

对CMnz蛇毒引起溶血的组分进行了鉴定，用DEAE-Cellulose或DEAE-Sephadex 分离CMra蛇毒得到了一种蛋白组分，这种蛋白具有补体依赖溶血作用，用鸽红细胞在鸽 血清的存在下可以引起溶血反应。这种蛋白不同于DLF，它的分子量为14 000,可能为酸 性蛋白，在无血清存在下，用经洗涤的鸽红细胞不发生溶血。

现在认为CVF可能先通过水解C3因子而使C3被激活，C3被激活后就可以启动整 个补体系统。由于被激活的补体系统作用在红细胞膜上，所以最终引起溶血。一般认为 CVF与红细胞膜结合,所以提供了补体在细胞膜上作用的位点。CVF和C3之间的作用需 要两种血清因子参与，一种因子富含甘氨酸称为糖蛋白(GBG)，另一种因子是低分子 量的D因子。Vogt(1974)发现了 C3被激活的过程,CVF和GBG通过Mg2+的帮助而相 互结合，这种结合使GBG的构象变化而易与D因子结合，D因子可能是一种蛋白水解 酶，它对GBG进行水解，这时CVF与GBG被水解的一个片段仍稳定地结合，这种复合 物能够水解C3而使其激活。