蛇毒蛋白的分离技术 离子交换层析的操作

（一）兑换代理人的选择

选择交换器时，必须考虑以下因素： 分离出的物质是何种电荷；分离物质的分子大小；被分离物质所在的环境，特别是环境中是否有其他离子共存，这些离子具有什么样的性质、数量；被分离物质的理化性质，是否耐酸、碱、高温等；分离物质的大概数量；什么样的交换器可用及其性能。如果对被分离物质的性质了解不多，应通过前期实验完成换热器的选型。

在阳离子交换树脂中，磺酸型是应用最广泛的。可用于酸碱及中性溶液，可与简单和复杂的无机或有机离子进行交换。但带正电荷的胶体和聚合物阳离子不能被吸附或吸附很少。氨基酸等两性化合物也可用于交换吸附。含苯酚的弱酸型不宜在碱性溶液中使用，特别是在高温（80）下，树脂容易被浸透。羧酸型阳离子交换剂选择性更强，可用于强碱和弱碱的分离，也可用于碱性氨基酸的分离。链霉素等有机碱也可用它提纯。这类交换剂对氢离子有很大的亲和力，少量的酸就可以置换碱，因此再生程序简单。阴离子交换树脂与阳离子交换树脂类似，具有强碱的具有广泛的应用范围。强碱型和弱碱型均可在酸性溶液中使用。但碳酸、硼酸、硅酸等弱酸不能与弱碱交换，必须用强碱除去。在中性溶液中，宜使用强碱或中等强碱型交换剂，在碱性溶液中，宜选用强碱型。

对于离子交换纤维素的选择，最实用的方法是使用两种常用的离子交换剂分别进行测试。通常用1ml的小柱在低盐浓度（0.05mol/L）下用DEAE-纤维素（PH8）或CM-纤维素（PH6）进行测试。大多数蛋白质可以被其中之一或两者吸附。如果没有吸附作用，盐浓度可以降低到接近于零。最好能吸收，但不要太强，以利于下一步的洗脱。对于吸收太强不易洗脱的物质，可用交换当量较小的交换器代替。目前还没有相应的弱解离阳离子交换纤维素，而CM-纤维素可在极低pH下用于层析，降低CM-碱的解离度，从而降低其交换当量。如果需要在非常低或非常高的pH 值下进行层析，如果pH 值低于3.0，则可以使用P-纤维素或SE-纤维素；当pH 值高于10 时，可以使用GE-纤维素。

确定色谱法使用的交换剂类型后，还应选择交换剂的粒径。粒径主要影响分辨率和流速。粗颗粒堆积不紧密，单位体积交换容量小，空隙大，易造成区带分散，故分辨率低，但流速快。细颗粒分辨率高，交换容量大，但缺点是流速慢。当需要高分辨率时，使用细颗粒；当需要高速或阶段洗脱时，使用较宽的条带无害，可以使用粗颗粒。另外，柱子的尺度也有关系。粗颗粒不适合填充太小的柱子（直径1cm以上），细颗粒适合填充小的柱子，直径1mm的柱子也可以。

(2) 离子交换剂的制备

离子交换剂的制备是使交换剂成为适合于分离各种离子的形式。准备工作应包括以下四个步骤：

换热器中的杂质去除：杂质是由于生产时纯化不充分，即使纯化的很纯，在贮存过程中也会有少量分解。

交换器： 的溶胀该步骤将交换器的更多带电基团暴露于溶液中。

去除换热器中会影响流速的非常小的颗粒。

余下的离子交换剂： 将离子转化为所需的形式，即重塑。对于凝胶型换热器只需要最后两个步骤，其他类型的换热器必须经过所有四个步骤。

一般的换热器往往含有不溶于水的杂质。即使交换剂的纯度很高（如DE-52），在储存过程中也会发生氧化降解。因此，使用前必须充分清洗。洗涤的目的主要是去除杂质。对于聚苯乙烯或酚醛树脂，可用水、盐酸、碱、乙醇洗涤，最后用高浓度抗衡离子洗涤。一般程序是将：干树脂用水浸泡2小时，捞出水分，用去离子水洗至清澈，捞出后用4倍量的2mol/LHC1洗涤4小时。水。去酸，用水洗至中性，去水后用4次2mol/L NaOH洗涤4小时。去碱，用水洗至中性。必要时用乙醇清洗。

纤维素是单糖的聚合物，其羟基被带电基团取代。干燥时，由于缺少水分子，分子中的羟基结合在一起，导致形成致密堆积的糖聚合物，许多官能团被掩埋。当纤维素悬浮在水中时，这些很少的氢键被破坏。完全膨胀需要用更强的条件处理，即悬浮在强酸或强碱溶液中，通常为0.5m0l/L HCl或NaOH。操作步骤同树脂清洗。对于阳离子交换纤维素，先用0.5mol/L NaOH洗涤，再用0.5mol/LHCl洗涤；对于阴离子交换纤维素，先用HCl 洗涤，然后用NaOH 洗涤。每次洗涤后，用大量清水冲洗至中性。有时这个过程会重复几次。该步骤对于去除牢固吸附在交换器上的杂质是必要的。

去除换热器中细小颗粒的方法是将换热器悬浮在大量水中。 90%95%的颗粒沉降后，将沉降较慢的部分倒掉，否则柱流速慢，分离度差。

最后用合适的抗衡离子平衡，即交换剂的修饰。所谓改造，就是让交换器携带需要的离子。通常，大量、高度浓缩的抗衡离子溶液通过交换器。例如，如果需要在阳离子交换剂上携带Na+，则用NaOH溶液处理；如果需要在阴离子交换器上携带Cr，则用HCl 溶液处理。重构后用水或稀释缓冲液洗脱去除多余部分，层析起始缓冲液也用平衡去除多余部分。这样处理过的交换器可以使用了。

另一个需要考虑的重要色谱条件是色谱过程中的pH 值。通常使用缓冲液来维持色谱介质的pH 值。对于缓冲液的选择，应始终考虑以下四个因素： 阴离子交换剂应使用阳离子缓冲液；阳离子交换剂应使用阴离子缓冲液。如果缓冲液的离子电荷与离子交换剂的离子电荷相同

相反，那它就参加离子交换过程，并降低离子交换剂的缓冲容量，引起pH变化。② 选用的pH值决定于被分离物质的等电点、稳定性和溶解度，也要根据交换剂解离基团的 PK值。用阴离子交换剂要在低于其pK值的范围内层析;用阳离子交换剂要在高于其pK 值的范围内层析。总之，缓冲系统的pH值要这样来选择:在这个pH值，要分离的离子所 带的电荷种类与离子交换剂的平衡离子所带电荷种类相同。对于等电点在层析的pH范 围内的蛋白质，这个考虑特别重要。③缓冲液离子的PK值要在所要用的pH值附近 (士0. 7之间），这样才能有较高的缓冲能力，否则，缓冲容量低，pH可能改变，出现pH交 错界面，产生假峰。④缓冲系统的选择应不影响被分离物的活性、溶解度，不干扰其分析。 被分离物需要制成不含盐的干样品时，以用挥发性缓冲液为宜。

(三）层析柱的选择及装柱

要得到好的层析效果，必须考虑以下五个方面的问题:层析柱的高度与体积;上样量 的大小;所采用的洗脱梯度的形状和洗脱液量的多少;洗脱速度;分离物收集量的多少。

1.层析柱所用交换剂的体积，也就是装在柱中的交换剂的体积(一般叫柱床体积）， 至少要比束缚所有样品所需要的体积还要大2倍〜5倍。柱的形状一般以直径与高度之 比为1 : 15为宜，也有采用1 : 10〜1 .. 30的，总之，柱形应根据层析条件和需要而定。当洗 脱过程中梯度的变化比较剧烈时(如阶段梯度洗脱），则不能用过长的柱，否则区带扩散较 宽，降低分辨率。区带变宽的程度与柱形状有关:细长柱的分辨率显著低于直径与高度之 比较高的柱。分辨率较低的原因是，洗脱过程中存在着梯度的急剧变化。当平衡离子的浓 度高得足以置换吸附离子的时候，此离子就从柱上下来，而且它的移动速度与溶液移动速 度相同，因为这时这些离子在溶液中是自由的。如果从吸附点到收集点须走很长距离，那 么每一个吸附物质都有扩散的机会,因此形成的峰带就宽，特别是在分离静电荷很不同的 物质时更是这样，因此，如果必须增加离子交换剂的体积的话，就应增加柱的直径。

2.装柱处理好的交换剂在装入层析柱时，质量的好坏对层析效果影响很大。对装柱 的要求是，交换剂在柱中的分布要均匀，严防有“节”和气泡产生。所谓“节”是指交换剂在 柱内有明显的分界线，这是由于装柱时交换剂沉降不均匀，造成交换剂在柱内排列松紧不 一所致。气泡则是由于交换剂未被溶液完全包裹而与空气接触所引起。防止节与气泡产 生的方法是装柱内先保持一定高度的水分(一般为柱长的1/3)，加入交换剂时使交换剂 借水的浮力而慢慢沉降。如果保持交换剂面上水的高度不变(可用排泄口放水的办法来控 制），而且交换剂又是连续地缓慢沉降，“节”与气泡就不会产生。

(四）加样及洗脱

装柱完毕后，用水或缓冲液平衡到所需的条件，如特定的PH值、离子强度等，即可上 样品液。样品应与起始缓冲液具有相同的pH值和离子强度。可用透析、凝胶过滤或稀释 法处理。稀释法是先将样品溶液调到所需要的pH值,然后加水稀释至与起始缓冲液具有 相同的电导度。这个方法对于洗脱液的前一部分的分辨率要求不高时可以使用。加样的 体积一般关系不大，但上柱前样品应离心除去不溶物，否则容易将柱堵住。用缓冲容量大 的离子交换剂（如羧酸型)进行的层析，有时可以免去这一步。

加样的方法是，首先排除床表面的缓冲液，再用移液管加样。加样时，移液管尖端接触 柱内壁并在离床表面数毫米处，一边加一边沿柱内壁转动一周，然后迅速移至中心，使样 品尽快分布于全表面，然后打开出口，继续加样，待样品全部进入床内后，以少量起始缓冲 液(0. 5ml〜lml)冲洗内壁数次，再加足缓冲液，开始洗脱。加样时要注意不要把床表面破 坏，否则，层析区带会不整齐。如有破坏，可搅起数毫米交换剂，使其自然沉降平整为止。

从离子交换剂上洗脱不同的离子是离子交换层析中需要控制的重要因素。洗脱液体 积(相对于柱床体积而言)的大小和洗脱梯度的形状(盐浓度的变化能力)对柱的分辨率影 响极大。洗脱可以用恒定组成的起始缓冲液来完成(简单洗脱），也可以用改变PH值或盐 浓度的方法，或二者均改变的洗脱液来完成。pH值和盐浓度的改变又分为连续改变(梯 度洗脱)和不连续改变(阶段洗脱）。

混合室B中装层析分离开始时使用的溶剂，储存器A中装洗脱液用以增加流动相的洗脱 能力，液流从B流入柱中，而洗脱液将以同样流速从A到B，所以B中液体体积不变。洗 脱液和溶剂的混合由设置的电磁搅拌装置E完成。

Cr是流出体积V后洗脱液的浓度，是储存器A中的浓度，是混合室B中开始 洗脱时洗脱液的浓度，VB是在B中液体体积。 比较高的柱。分辨率较低的原因是，洗脱过程中存在着梯度的急剧变化。当平衡离子的浓 度高得足以置换吸附离子的时候，此离子就从柱上下来，而且它的移动速度与溶液移动速 度相同，因为这时这些离子在溶液中是自由的。如果从吸附点到收集点须走很长距离，那 么每一个吸附物质都有扩散的机会，因此形成的峰带就宽，特别是在分离静电荷很不同的 物质时更是这样，因此，如果必须增加离子交换剂的体积的话，就应增加柱的直径。

2.装柱处理好的交换剂在装入层析柱时，质量的好坏对层析效果影响很大。对装柱 的要求是，交换剂在柱中的分布要均勻，严防有“节”和气泡产生。所谓“节”是指交换剂在 柱内有明显的分界线，这是由于装柱时交换剂沉降不均匀，造成交换剂在柱内排列松紧不 一所致。气泡则是由于交换剂未被溶液完全包裹而与空气接触所引起。防止节与气泡产 生的方法是装柱内先保持一定高度的水分(一般为柱长的1/3)，加入交换剂时使交换剂 借水的浮力而慢慢沉降。如果保持交换剂面上水的高度不变(可用排泄口放水的办法来控 制），而且交换剂又是连续地缓慢沉降，“节”与气泡就不会产生。