蛇毒蛋白的分离技术具体操作

随着现代科学技术的发展，液相色谱技术逐渐应用到化学的各个领域。应用范围可分为三个方面：制备色谱； 定性分析； 定量分析。

HPLC 中样品分析的主要步骤：

(—)进样前准备

首先使用的溶剂，即流动相，对纯度要求较高。有机溶剂必须提前重蒸；水必须用混合离子交换树脂和活性炭处理，并在使用前重新蒸馏以去除各种杂质。盐通常必须重结晶。

各种溶剂在使用前一般都需要新鲜配制和脱气。

挥发性有机溶剂通过超声波振荡脱气时间更长。水和缓冲液通过微孔膜过滤除去固体颗粒，然后加热并缓慢搅拌（在电磁搅拌器上），抽真空除去气体。

加样前，必须用流动相充分冲洗色谱柱，待流出液通过检测器基线校正，证明色谱柱中残留杂质已完全去除后，方可进样。

进样时，样品完全溶解在与流动相相同或可混溶的溶剂中。如果有悬浮颗粒，需要过滤去除，然后通过注射器或进样阀进样。进样量取决于不同的柱容量。一般制备柱每次最大上样量可达10mg~1000mg。

(2)洗脱

进样后的洗脱条件通常按照预先设计好的溶剂程序进行，一般包括：

每个色谱计划所需的时间。

洗脱液（即流动相）的组成（单位或多组分）和形成梯度的要求。如果样品各组分与固定相的亲和力差异较大，可采用梯度洗脱法（包括改变极性、pH和离子强度）以获得更好的分离效果。

流动相的流速为恒速或变速或各段所需的流动相流速。

事实上，样品展开后得到的色谱图很难一次性获得良好的分离效果。需要根据色谱图中各组的峰形和位置进行综合分析，根据您需要制备的组分的峰分离度调整流速。相极性（或离子强度）梯度组合、流速和展开时间等。现代高效液相色谱一般都有自动控制程序装置，加上检测温度和pH对分离的影响，直到获得较好的分离条件。选定后，开始大规模分离，收集所需的成分。

样品加入各种色谱柱后如何选择合适的洗脱液（即流动相）的基本原理与经典的色谱洗脱法大致相同。例如液-液分配色谱的正相色谱和反相色谱的操作原理大致如表3_13_8。

表3-13-8 正反相色谱操作原理

正相

反转

固定相极性

强大的

虚弱的

溶剂的极性

弱到中等

中到强

样品洗脱程序

较少极性的组分首先洗脱

强极性组分首先洗脱

增加溶剂极性的影响

减少洗脱时间

增加洗脱时间

当然，HPLC 制备色谱要求流动相与检测器匹配，同时获得更大的分辨率。因此，在使用有机溶剂时，要求其具有低粘度和一定的挥发性。其中，最常用的有机溶剂有乙腈、甲醇、二氯甲烷、己烷、硝基丙酮等，一些厂家生产的色谱柱对某些溶剂的使用也有限制，应引起注意。

(3) 色谱柱的清洗和存放

色谱分离完成后，应将色谱柱用溶剂彻底清洗，色谱柱长期存放后使用后应定期清洗。硅胶柱先用甲醇和乙腈洗涤（乙腈比较贵，可以少用，甲醇多用），然后用无水二氯甲烷洗涤，保存。烷基键合相色谱柱可用甲醇-氯仿-甲醇-水交替洗涤，去除脂溶性和水溶性杂质。离子交换柱按一般经典方法用酸碱缓冲液平衡后用水和甲醇洗涤。根据所用流动相的不同，用甲苯、四氢呋喃、氯仿或水大量冲洗凝胶柱。但亲水性凝胶等亲水性色谱柱在储存时，常加入少量甲苯或氯仿，以防止微生物污染。