蛇毒中乙酰胆碱酯酶

（-） 概述

乙酰胆碱酯酶存在于某些鱼类的电器官神经组织、动物血清、红细胞和视网膜中，眼镜蛇毒和海蛇毒中也含有这种酶。由于乙酰胆碱酯酶在神经传导中的重要作用，早在本世纪初就引起了生化工作者的重视。关于动物组织中乙酰胆碱酯酶的纯化和性质已有许多报道和综述。乙酰胆碱酯酶在动物组织或细胞中以不溶性形式存在。要提取这些酶，必须首先将酶从颗粒中溶解出来，颗粒通常用表面活性剂和高盐溶液处理。但是，有些经过这样处理的酶在离开原有体系后会发生聚合反应，也可能导致酶的微观结构发生变化。蛇毒中的胆碱酯酶是一种可溶性酶，因此它的纯化可以避免这些处理，并且使用更温和的手段，对用这种方法纯化的酶的研究可能更接近酶的天然状态。

蛇毒中的乙酰胆碱酯酶最早是由Iyenger 等人在眼镜蛇毒液中发现的。 （1938 年）。随后的研究表明，这种酶只存在于海蛇毒液和眼镜蛇毒液中，很少见于响尾蛇毒液和毒蛇毒液中。 Nachman-sohan (1942) 发现眼镜蛇毒液中的乙酰胆碱酯酶活性比电鳗组织中的乙酰胆碱酯酶活性高100 倍。过去认为这种酶与眼镜蛇毒的神经毒性有关，但在用电泳法将眼镜蛇毒和金克拉塔毒的胆碱酯酶与其他成分分离后，发现胆碱酯酶不再具有神经毒性。目前已知眼镜蛇毒的神经毒性是由神经毒素引起的，与乙酰胆碱酯酶无关，乙酰胆碱酯酶的作用还有待进一步研究。

该酶以下列方式催化乙酰胆碱酯的水解：

CH30CH3

CH3—N+—CH2—CH2—o—c—CH3—CH3—N+—CH2—CH2—OH+CH3COOH

/

ch3ch3

(2)分离纯化及理化性质

在艾扬格等人之后。 (1938) 在眼镜蛇毒液中发现乙酰胆碱酯酶，Zeller 等人进一步研究。 (1948)证明这种酶主要存在于眼镜蛇毒液中，而在响尾蛇毒液和毒蛇毒液中则没有这种酶。人们已经从各种眼镜蛇的毒液中纯化出乙酰胆碱酯酶，包括：金环蛇、珊瑚蛇、丹山眼镜蛇亚种（.

过去，Na2S04 和(NH4)2S04 用于纯化N. 和蛇毒中的乙酰胆碱酯酶。后来，Kumar 等人。 (1973)结合DEAE-Cellulose离子交换和亲和层析纯化酶，得到纯品。 Kumar使用的亲和凝胶是连接三甲基-(间氨基苯-)-氯化铵的SepharOSe4B凝胶，该方法纯化的蛇毒中乙酰胆碱酯酶的获取率高达59%。

5、蛇毒中的酶在2C至4C下保存数周不影响其活性，在-16C下保存也很稳定。该酶的分子量约为126000，能被8mol/L尿素（包括1mol/LNaCl）分离成两个大小相同的亚基，说明该酶是一种寡聚酶。用氨甲酰试剂邻硝基苯二甲基氨基甲酸酯滴定乙酰胆碱酯酶，发现每个酶分子中有两个活性位点，与上述结果相同；乙酰胆碱酯酶，发现基本亚基呈环状，直径为5.0 nm，亚基可聚集形成四聚体，但最常观察到二聚体。对该酶的氨基酸组成进行了分析，有趣的是它与电鳗乙酰胆碱酯酶的组成相似。从蛇毒中分离出的乙酰胆碱酯酶的最适pH为8.5，浙江蕲蛇毒中该酶的最适pH为7.5。两者的最佳反应温度在38X: ~40'C 的范围内。纯酶不仅水解乙酰胆碱，还水解其他酯类化合物，包括乙酰硫代胆碱(Km=16.6X10_6m0l/L)、乙酰-J3-甲酰胆碱(516.6umol/L)、丙酰胆碱(33.l)umol/L、苯乙酸(1.14mmol/L) 和吲哚乙酸苯酯(33.1mmol/L)。该酶的首选底物是乙酰胆碱，其次是乙酰硫代胆碱。底物浓度过高时，酶的活性受到抑制，DFP毒扁豆碱、咖啡因（咖啡因）和吗啉也可抑制。 Trimethyl-(m-acetanilide)ammonium iodide 是乙酰胆碱酯酶(Ki=76.7um0l/L) 的竞争性抑制剂。

我国的于伟明等。 (1981) 用亲和层析从浙江眼镜蛇毒中纯化乙酰胆碱酯酶。纯化后的酶活性比粗毒高440倍，比活达到230mmol/mgh。亲和吸附剂的制备是以Sepharose4B为载体，六亚甲基二胺为臂，(间羧苯基)-二甲基乙基碘化铵为配体。不同长度的“臂”对酶的吸附有影响。烷基越长，吸附越强。疏水性强的“臂”对酶的吸附力也更强。曲先明等。等(1981)研究了该酶的理化性质，发现其反应的最适pH为7.5，反应5分钟的最适温度在3839之间，Km值为1.25mol/L .稀酶液不稳定，0.1%的明胶有利于酶的稳定。粗胆碱酯酶和纯化胆碱酯酶的底物抑制谱和Km 值相似，表明酶在纯化过程中没有改变。分离出的酶可被多种有机磷化合物（如DEP、敌敌畏、对氧磷）抑制，一些氨基甲酸酯和含有季铵盐的化合物也表现出抑制作用。从浙江眼镜蛇毒中分离出的乙酰胆碱酯酶由几种同工酶组成，经SephadexG-200凝胶过滤可分为两个对称的酶活性峰，与蛋白峰完全吻合。凝胶电泳后，蛋白染色可见约3条蛋白条带，酶染可见6条条带。免疫扩散和免疫电泳显示相同的结果，即使两次亲和层析后的制剂仍然相同。邱雪珍等。 (1984)证明这些同工酶不是由于提纯或电泳过程中产生的畸变，而是原存在于粗毒物中。事实上，眼镜蛇蛇毒中乙酰胆碱酯酶的同工酶已经被报道了很长时间，Lee 等人。

 蛇毒中测有4条同工酶带，在等电聚焦中分别为8条、10条。这些同工酶 分子量相同，只是电荷不同。浙江眼镜蛇毒无论是蛇毒干粉或纯化得到的酶，在凝胶电泳 上都可分离得到6条带。6条带之间分子量可能并无显著差别，而只是电泳行为不同，至 于不同形式胆碱酯酶结构和功能的关系尚待进一步研究。

Tan等（1988)从紫棕烙铁头 蛇毒中部分纯化出一种乙酰胆碱酯酶。该酶分子量为58 600,其活性能被毒扁豆碱和水杨酸盐强烈抑制。如底物浓度过 高，也能部分抑制其活性。紫棕烙铁头蛇毒中乙酰胆碱酯酶的含量不少于0.3%。过去认 为响尾蛇毒和蝰蛇毒不含乙酰胆碱酯酶，Tan等的发现是一种特例。除此之外，Bhat- tacharya和Gaitonde也在锯鳞蝰蛇毒中发现并部分纯化了乙酰胆碱酯酶。

(三）不同来源乙酰胆碱酯酶的比较

早期，Mounter等（1951)和Augustinsson等（1951)指出，眼镜蛇科蛇毒中的胆碱酯 酶类似于动物组织中的乙酰胆碱酯酶。Kumar等（1973,1975)以金环蛇 蛇毒作为材料、Java等（1976)、Raba等（1979)和Kesvatera等（1979)以外里海亚 种眼镜蛇 蛇毒为材料纯化胆碱酯酶并研究了它们的性质。他们认为蛇 毒乙酰胆碱酯酶的底物专一性与高等动物红细胞中的酶十分相似，蛇毒酶分子形态则与 鱼电组织或其他高等动物组织中的酶相似。然而蛇毒酶的分子量小，它的结构显然比其他 动物组织膜上的酶简单。金环蛇和外里海亚种眼镜蛇两种蛇的蛇毒酶相比较，性质也有不 同，例如以乙酰-P-甲基胆碱作为底物时，金环蛇毒酶不表现底物抑制活性，而眼镜蛇毒酶 则明显地有底物抑制现象，说明这两种酶至少在构型方面有差别。余微明（1981)研究浙江 眼镜蛇的乙酰胆碱酯酶性质，发现该酶与一些典型的膜乙酰胆碱酯酶有不少共性。例如水 解乙酰胆碱比水解其他胆碱酯快，能被某些有机磷、氨基甲酸酯及一些所谓真性酶抑制剂 所抑制，酶活力能被高浓度底物抑制。但它是一种非膜的可溶酶，不像膜上的酶容易聚合， 与脑中的酶、鱼中的酶没有免疫交叉反应，因而可能具有它独特的结构特征，也就是说它 们之间没有共同的抗原决定簇，因而也说明抗原决定簇和酶的活性中心不在同一个部位。 抗原抗体络合后仍能进行酶显色也说明了抗原决定族和酶活性中心不在酶分子的同一部 位。

(四）生理作用

早期有些工作者认为蛇毒中的胆碱酯酶是蛇毒毒性的主要部分，但并无实验证据。 1960年Yang等用区带电泳法从台湾眼镜蛇等几种蛇毒中分离出胆碱酯酶，观察到具有 蛇毒毒性的部分并不是胆碱酯酶的活性部分，所以他们认为蛇毒的毒性与胆碱酯酶无关。 60年代后期对蛇毒多肽毒素’的分离研究阐明了蛇毒的毒性问题，但是有些工作者仍认为 蛇毒中的胆碱酯酶对蛇毒的毒性有配合和辅助作用。近年来，前苏联科学家用CD42抑制 外里海亚种眼镜蛇毒胆碱酯酶的活力，发现蛇毒的毒性下降，在蛇毒的神经毒素I中加入 胆碱酯酶能增强蛇毒的毒性。总之，眼镜蛇科蛇毒中含有非常丰富的胆碱酯酶，但其生理 意义目前尚不明确。屈贤铭等（1兆1)对浙江眼镜蛇毒生物毒性测定的实验结果是与

Yang的工作一致的，但也有若干可供探讨的地方。在亲和层析柱流出液中还含有少量的 胆碱酯酶，是否与蛇毒的毒性有关，有待进一步研究。以纯化的胆碱酯酶腹腔注射4只小 白鼠，每只用量为500Mg，4只全部死亡，是胆碱酯酶本身的毒性，还是在此酶中尚含有其 他杂质所致呢？这种杂质是蛇毒的毒素蛋白还是其他的大分子成分呢？这些问题尚待进 —步探讨。

从眼镜蛇外里海亚种 蛇毒中发现有乙酰胆碱酯酶抑制因子，这种因子对乙酰胆碱酯酶有抑制作用，其活性可以被多种阳离子可逆地抑制，0. 06mol/L的 Mg2+作用最强。已经知道这种抑制因子就是该蛇毒中的心脏毒素。它虽然能强烈抑制蛇 毒中乙酰胆碱酯酶的活性，但对哺乳动物体内的乙酰胆碱酯酶没有影响。