(一)原则
1968年以来，Margolis和Slater先后采用凝胶浓度梯度电泳或孔径梯度电泳作为分离鉴定蛋白质的方法，并首次将此方法用于分子量测定。这种方法不同于圆盘电泳，圆盘电泳是在均匀浓度的聚丙烯酰胺凝胶上进行的电泳。后来，R0db0rd 等人。比较了线性梯度和非线性梯度电泳以及在均匀凝胶浓度下的电泳，证明梯度凝胶电泳的分辨率更好。
在线性梯度凝胶电泳中，蛋白质在电场中向凝胶浓度增加的方向迁移，即孔径逐渐减小的方向。随着电泳的继续，蛋白质越来越受到孔径的阻碍。首先，蛋白质在凝胶中的迁移速度主要受两个因素影响：一是蛋白质本身的电荷密度，电荷密度越高，迁移速度越快；二是蛋白质本身的大小，分子量越大，迁移速度越快慢。当蛋白质迁移的阻力大到足以完全阻止其前进时，电荷浓度低的蛋白质将“赶上”大小相似但电荷密度更高的蛋白质。因此，在梯度凝胶电泳中，蛋白质最终迁移的位置只取决于其自身分子的大小，与蛋白质本身的电荷密度无关。梯度凝胶电泳情况如图3_13-12所示。
图中的方块代表凝胶的孔径，孔径从上到下逐渐变小，形成梯度。图中的球体代表三种不同的蛋白质分子：大、中和小。 A代表电泳开始前的分子分布，B代表长时间电泳后的分布。大小不同的分子全部进入凝胶孔梯度，大分子和小分子分别滞留在分子大小相同的凝胶孔中，不再向前移动，因而分离，形成三个区。从以上讨论可以看出，分子筛效应在梯度凝胶电泳中更为突出。由于蛋白质的相对迁移率在一定范围内与其分子量的对数呈线性关系，因此通过制作标准曲线，在相同条件下对未知样品进行电泳，即可确定未知蛋白质的分子量。 (2) 特点
与均相凝胶电泳相比，梯度凝胶电泳具有以下优点：
具有浓缩样品中各成分的作用。在样品太稀的情况下，可在电泳过程中分2-3次加入样品，不同大小的分子最终会停留在相应的凝胶孔隙中分离。
提供更清晰的蛋白质条带，因此可用于鉴定蛋白质纯度。
可以在一张凝胶切片上同时测定分子量范围广泛不同的蛋白质。例如：凝胶浓度为4%~30%梯度凝胶可分辨的分子量范围为50,000~2,000,000。
可直接测定未解离成M基团的天然状态蛋白质的分子量。该方法与用于分子量测定的SDS 凝胶电泳相辅相成。
梯度凝胶电泳主要适用于测定球蛋白的分子量，但对纤维蛋白会产生较大的误差。此外，由于只有当未知蛋白质和标准蛋白质达到规定的凝胶孔径时（即完全阻止迁移时）才能确定分子量，因此在电泳过程中需要足够高的伏特小时（通常不低）。小于2000Vh)，否则达不到预期效果。因此，用这种方法测定蛋白质的分子量具有一定的局限性。
(3) 操作方法
1、试剂制备储备液:称取10.75g Tris、5.04g硼酸、0.93g EDTA(EDTA-2Na.2H20)，用蒸馏水溶解，测pH为8.3，定容至1000ml。 储存液: 称取57.6g丙烯酰胺和2.4g亚甲基双丙烯酰胺，溶于储存液，定容至100ml，过滤。 液体 :
取丙烯酰胺7.68g、亚甲基双丙烯酰胺0.32g，溶解于储备液中，定容至100ml。 储存液: 取四甲基乙二胺（TEMED）0.3ml，溶解于储存液中，稀释至100ml。 称取0.3g过硫酸铵原液:溶解于原液中，稀释至100ml，临用配制。 电极缓冲液[0.09mol/LTris-0.08mol/L硼酸-0.0025mol/LEDTA(pH8.4)] :称取10.98g Tris，4.95g硼酸，0.9380-Dingbacadingba-21^.2 Torr 0) , 强制[|7 溶解不足， 并将体积设置为1001111。 (2) 25% 乙醇。 _.1%溴酚蓝指示剂。 固定液：10%磺基水杨酸溶液。 染色液（0.1%考马斯亮蓝R250-25%甲醇-10%乙酸溶液） : 称取考马斯亮蓝R250 1g，溶于250ml甲醇，加100ml冰醋酸，用水稀释至1000ml。 脱色液（25%甲醇-10%醋酸）：取甲醇250ml，冰醋酸100ml，加水定容至1000m丨。 7%醋酸。 标准蛋白：瑞典Pharmacia公司生产（见表3-13-13）。
表3-13-135 标准蛋白
蛋白质名称
分子量
来
来源
甲状腺球蛋白，
669000
猪甲状腺
p>铁蛋白440 000
马
肺
过氧化氢酶
232 000
牛
肝
乳酸脱氢酶
140 000
牛
心
血清清蛋白
67 000
牛血清
仪器的准备①电泳槽:本实验所用的电泳槽为垂直板型电泳槽。使用前装好，试 漏。②梯度混合器:本实验所用的梯度混合器容积小，其直径为1. 8cm，高5. 3cm，较大容 量为15ml。③用直径1. 5mm〜2. 0mm的聚乙烯管将梯度混合器、蠕动泵、凝胶膜相连。
4%〜30%梯度胶的制备预先准备好配胶的全部贮液，计算出凝胶膜所需的体 积。
4%胶液的配制：贮液© :贮液④：贮液④=2 : 1 : 1(体积比），取3. 5ml贮液 ©，加1. 75ml贮液@，混合后抽气，再取1. 75ml贮液©，单独抽气后将两溶液混合。
30%胶液的配制：贮液⑥：贮液⑥：贮液© = 2: 1 : 1(体积比），取3.5ml贮液 ®，加1. 75ml贮液@，混合后抽气，再取1. 75ml贮液©，单独抽液后将两液混合(注意： 贮液④要在灌入梯度混合器前临时混合，以免胶液过早聚合）。
制备4%〜30%的梯度胶-灌胶:将7ml 4%的胶液加入贮液瓶，7ml 30%的胶液 加入混合瓶。打开电磁搅拌及梯度混合器的开关，接着起动蠕动泵，将梯度混合器中的溶 液缓缓输入凝胶中。事先将输液管出口由凝胶膜上口中央伸向底部，随着凝胶膜内液面的 升高逐渐提高输液管，使管口始终接近液面而不伸进液体内部。控制流速在lml/min〜 2ml/min，约lOmin灌胶完毕。
于梯度胶面上小心加入25%乙醇约3mm高。静置30min后即可聚合。
待胶液聚合后，取出上面含醇的水层，取2ml 4%胶液洗梯度胶面，吸出后，再加 3ml 4%胶液于梯度胶上，于此胶液中插入样品槽模板，使其下沿刚好接触梯度胶面而不 要伸进胶内。再于此胶液上小心加入2mm〜3mm高的水层，静置，待聚合后，于室温放置 老化半小时后方可使用。
预电泳小心取出样品槽模板，用滤纸条吸去槽内的水分。于两个电极槽内加入电 极缓冲液，接通电极槽中冷却回流管和自来水管，然后接通电源，上槽接负极，下槽接正 极，维持电压70V，预电泳20min。
加样标准蛋白质样品的制备:将5种标准蛋白质样品按lmg/ml的浓度溶于含 20%蔗糖的电极缓冲液中，加入5W 0. 1%溴酚蓝溶液作指示染料，混合后加入样品槽内。 通过指示染料在样品槽内的分布可以直接观察加样情况。
待测样品的制备同标准蛋白质。
在测定分子量时，待测样品和标准样品要在同一个凝胶片上进行电泳。
电泳接通电源，将电压调至70V，电泳15min后样品缓缓进入胶内（30min后染料可跑 出胶片）。
接通并起动蠕动泵，开始使上、下两电极槽中电极液回流。
将电压升高到150V，维持恒定电压，电泳15h〜16h。电泳至少要2 OOOVh，若冷 却条件好，可升高电压，缩短电泳时间。
固定、染色、脱色
固定：电泳结束后，取出凝胶片，置培养皿内，用固定液浸泡30min。
染色:将固定过的胶片用染色液浸泡过夜。
脱色:可用以下两种方法脱色：
电泳脱色：将染过的胶片夹在两片塑料纱之间，垂直放在装满7%乙酸的电泳槽 内，电极位于塑料纱两侧，维持电压24V，电泳45min。
扩散脱色:将胶片浸于脱色液内，每隔2h换1次脱色液，直到胶片出现无色透明清 晰的谱带。若同时采用低于50‘C的水浴加温，可缩短脱色时间。
分子量的测定
标准曲线的制作:以凝胶片的前沿或迁移距离较大的标准蛋白质为参考点，计算 每种标准蛋白质的相对迁移率(Ms)。
M 蛋白质从原点迁移的距离
从原点到参考点的距离.
以值为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上制作标准曲线。
未知样品分子量的测定:测定出未知蛋白质的相对迁移率，利用标准曲线便可计 算出分子量。
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