诊断用蛇毒抗体的制备

实验室和临床诊断用蛇毒抗体的制备包括蛇毒抗原的纯化、免疫方法和动物选择、抗蛇毒血清的纯化等。这些步骤必须掌握好，才能制备出特异性强、亲和力好、效价高的蛇毒抗体。

1. 蛇毒抗原的制备制备过程应包括三个步骤：蛇毒抗原的纯化、小分子蛇毒半抗原与大分子量颗粒状物质或蛋白载体结合形成完整抗原、选择合适的免疫佐剂。

蛇毒抗原的纯化： 蛇毒是一种复杂的抗原。所谓纯化，就是从没有其他抗原成分的复合抗原（粗病毒）中选择性地去除所需的单一抗原成分，从而制备出高度特异性的抗体。这种纯化的要求将取决于不同的目的。制备抗出血毒素的抗体，需要对出血毒素进行分离纯化；制备神经毒素抗体，需要分离神经毒素；消除。具体方法根据纯化后的蛇毒抗原的理化特性，可采用以下一种或多种合适的方法进行纯化。具体纯化方法在第十三章“蛇毒蛋白分离技术”中已有论述，此处不再赘述。

纯化蛇毒抗原时，必须注意不要丢失正确的抗原决定簇和正确的抗原成分，否则会改变或降低其免疫原性。 Bjarnason 等人。报道称，在通过凝胶过滤去除西部小菜蛾响尾蛇奴隶nw:) 蛇毒出血毒素e 中90% 的锌后，其出血毒性和蛋白水解酶活性分别保留了10% 和12%。透析除去90%的锌后，只有5%的两种活性残留，加锌后只有20%的两种活性恢复。这表明凝胶过滤和透析可以改变这种出血性毒素的蛋白质分子结构，从而可能导致抗原性发生变化。此外，部分蛇毒成分的抗原（尤其是多肽等小分子）在纯化后会失去抗原性，应引起注意。

蛇毒中抗原的处理： 蛇毒中的某些多肽、核苷等半抗原必须与颗粒状或大分子蛋白载体结合才能具有抗原性。这种结合通常有两种方法：物理吸附和化学结合。

物理吸附剂有羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖硫酸钠、天然胶乳、碳粒等，它们可以通过电荷和微孔力学吸附蛇毒半抗原。

化学结合法是利用一些功能基因试剂将蛇毒半抗原连接到蛋白载体上。蛇毒多肽半抗原（带有游离氨基和羧基）可通过混合酸酐法和碳二亚胺缩合法与载体的氨基结合形成稳定的肽键，也可采用碳二亚胺缩合法合成代理人。氨基与载体的羧基缩合，多肽半抗原的氨基也可以通过戊二醛、2，4-二异氰酸甲酯等双功能基团结合剂与载体的氨基连接。蛇毒核苷的半抗原可通过过氧化物（高碘酸）氧化直接与载体结合。

当蛇毒半抗原连接到载体上时，需要注意的是：不能改变半抗原的结构和配置。载体应远离半抗原的免疫决定簇，并尽可能提高载体与半抗原的摩尔比。

掺入佐剂：佐剂可增强蛇毒抗原的免疫原性，改变机体免疫反应性，提高机体免疫反应能力，产生更高滴度的蛇毒抗体。常用的具有蛇毒抗原的免疫佐剂及制备方法有：

弗氏佐剂：有两种类型：不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。前者由液体石蜡和无水羊毛脂组成（一般用2:1，放置4X后68.6kPa高压灭菌15min：备用），后者在不完全佐剂的基础上加入死结核杆菌或活卡介苗（每1ml佐剂中含有制剂中5mg20mg，制备乳剂时加入)而成。

处理或纯化后的蛇毒抗原溶液必须经除菌过滤或加入双抗（使每1ml蛇毒抗原含1000单位青霉素和1g链霉素）后配制抗原乳剂，4杀灭过夜冰箱杂菌。

弗氏完全佐剂（或不完全佐剂）： 蛇毒抗原乳剂的具体配制方法如下：将油性混合物（不完全佐剂）加热融化后，取出所需量放入无菌研钵中，然后按上述比例缓慢滴加一定量的活卡介苗，边滴边研磨，使菌体完全散去。然后按1:1的体积滴加一定浓度的蛇毒抗原溶液，每加一滴都要研磨几圈，直到液滴消失。注意加入抗原的速度要慢。滴入所有抗原后，应该变成乳白色粘稠的油包水乳液。取一滴此乳液滴于静止的水面上，形成乳珠并保持完整不散开，说明已完全乳化。分装于无菌容器内41：贮存备用。

也可用注射器研磨法进行乳化。将等量的油混合液和蛇毒抗原卡介苗混合液分别吸入两个5ml带针头注射器中。用一根长约6cm~7cm的塑料管连接其中一根（注意孔径要合适，不能太松），针刺入1cm左右，然后轻轻推动针管，使液体进入塑料管子直到它离塑料管开口端1cm的距离。这时，另一个人将另一个5ml 注射器连接到塑料管的开口端。此时操作者面对面而坐，左手固定针头与注射器的连接处，右手交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂。

弗氏佐剂是最常用的佐剂，其免疫效果较好。一般来说，完全佐剂比不完全佐剂效果更好。

免疫方法

动物选择： 应选择强壮、健康、适龄的动物。通常用兔子、豚鼠、绵羊等。

可根据情况选择免疫途径、剂量和免疫周期。注射途径采用皮下、皮内、肌内、静脉、腹腔、足爪、淋巴结、内脏等。皮下和皮内注射抗原扩散速度慢，使抗原在局部组织停留时间长，特别是与佐剂混合的抗原可以使抗原缓慢释放，更有利于抗体的产生。静脉内和腹腔内注射抗原可迅速进入血液，一般用于增强免疫力。淋巴结注射能更好的刺激抗体的产生，有更好的免疫效果。蛇毒抗原和半抗原应在多个点皮内或皮下注射，或通过爪、皮下、淋巴结和静脉内途径注射。

蛇毒抗原注射液的剂量一般认为是少量多次注射或增量注射。 1976年，Dumarey用福尔马林黑颈眼镜蛇毒液a-毒素和弗氏完全佐剂免疫家兔，发现低剂量的抗原（总

量 375/ug)不能刺激或仅轻微刺激产生抗体，较高剂量(总量1 900Mg，86天免疫期）的抗原产 生了平均中和142LD,。。的a-毒素抗体。也有人认为较大剂量的抗原可获得更大成功。李 栋梁等(1979)用福氏不完全佐剂协同蝰蛇粗毒免疫家兔，从3. 5mg抗原开始1个月内注 射9次(背部皮下注射4次,肩后皮下注射3次，两后肢肌肉内注射2次），总蛇毒量达 259mg,休息2周后试血，4周后全采血。结果NO. 4家兔每lml血清可中和圆斑蝰蛇毒1 200/^(相当于185. 5小鼠LD5。）。但是不管怎样，为了防止动物中毒和免疫麻痹的发生， 一般认为应避免注入过量的抗原，特别是初次免疫时抗原量宜小不宜大。对于毒性较大而 未脱毒的蛇毒更应小心慎重处理。通常是经适当免疫(基础免疫)后再注入较大的抗原量 (加强免疫）。通常体重2kg左右的兔子首次免疫剂量是:未脱毒的粗全毒(与完全佐剂或 不完全佐剂乳化)从1/10〜1/5小白鼠LD5。的蛇毒(李云龙等，1980)开始做基础免疫，每 隔一周进行一次渐增量的加强注射，一直渐增到每次注射2LD5。〜5LD5。毒量(强毒蛇毒 如银环蛇可增至l0LD5(1〜20LD5。蛇毒量）。未脱毒的组分毒(与佐剂乳化者）,分子量在10 000以上者，抗原用量基本上同未脱毒的粗全毒。基础免疫可适当大些，可从1/5LD5。〜1/ 21^^毒量开始。分子量小(小于10 000)的分离组分毒(物理吸附或化学结合于大分子载 体并与佐剂乳化者)一般也是从1/5LD5。〜1/2LD5。(毒性强者用1/2，毒性弱的用1/5)，组 分毒开始基础免疫，每隔1个月或1. 5个月用1. 5倍〜2倍的增长量加强注射。加强注射 时用不完全福氏佐剂乳化，但需注意同蛇毒半抗原结合的载体必须始终一致，否则将影响 抗体的产生。脱毒的蛇毒抗原或半抗原的免疫剂量原则上比未脱毒者要稍大，一般可增大 2倍〜10倍(视具体蛇毒抗原而定），使有合理的适当量的蛇毒抗原或半抗原刺激机体以 产生较好状态的免疫应答。

免疫期一般为45天〜80天或稍长，这要视蛇毒抗原的免疫原性、佐剂、免疫方法和 动物的反应性而定。

制备诊断用的蛇毒抗体所用的蛇毒抗原是否要脱毒的问题，一般看法是蛇毒的毒性 蛋白成分皆有不同程度的毒性(特别是纯化的某些毒性很强的毒素，如神经毒素等毒性强 烈），有的分子量太小，因此小剂量免疫不能产生或只产生低滴度的抗体。大剂量免疫则易 引起动物死亡。但脱毒蛇毒抗原处理不当易丧失某些抗原结构，有的成分不易脱毒或有些 成分一经脱毒后即失去抗原性(Moror-Perlmutter，1963)。所以通常是把原毒抗原（小分 子量者需经吸附于大分子载体吸附)与免疫佐剂结合，注入机体以延长抗原的释放，减小 中毒反应，可以得到抗体谱全、效价高的抗原体。一般情况下，不一定需要脱毒的蛇毒抗原 来制备诊断用的蛇毒抗体。

免疫方案：

多点皮内、皮下注射法:基础免疫用适当含量的福氏完全(或不完全)佐剂蛇毒抗原 0. 4ml，在家兔两侧后足掌皮下、腹股沟或腋窝皮下各注射0. lml。2周〜3周后加强注射， 用lml福氏不完全佐剂蛇毒抗原在兔背部和腹部皮下多点注射，每点0. 2ml。以后每隔1 周用前量或递增量以同样途径和方法多点注射，连续重复注射6次〜8次，最后一次注射 后7天〜10天抽血试验，合格者采血。试血方法:常用环状试验和琼脂免疫双扩散法。前 者是在一系列装有待测血清的有底细管（内径2mm〜3mm)内，分别在血清上面小心加入 按倍比稀释的(原液为lmg/ml)免疫原(蛇毒)0. 05ml〜0. lml，室温中置lh后观察抗原 抗体界面上出现的白色沉淀环，以能出现明显( + + )沉淀环的蛇毒较大稀释度(即该蛇毒 抗原的绝对含量)为其血清的沉淀素效价。一般小于lOfxg/ml为合格。琼脂免疫双扩散法 是在1%琼脂板的中间孔内加入10W待检血清，四周孔分别加入一系列倍比稀释度的蛇 毒抗原(蛇毒血液为lmg/ml)放湿盒内，置37X： 24h后观察结果。以能出现沉淀线的蛇毒 的较大稀释倍数为其血清的沉淀素效价。一般要求蛇毒抗原的稀释倍数不低于1:50。如 果反过来稀释抗血清，中央孔加蛇毒抗原(lmg/ml)，则抗体的效价应不低于1:16为合格。

淋巴结免疫法:家兔两后足掌预先用活卡介苗(75mg/ml)各注射0. 31111。10天〜14 天后两侧胭窝淋巴结可肿大如蚕豆大小，用适当浓度的福氏完全或不完全蛇毒抗原

4ml，每个淋巴结注射0. 2ml，2周后用倍量蛇毒的福氏完全或不完全佐剂抗原0. 4ml 按上法注入2个淋巴结内。以后每隔1周重复注射1次(蛇毒剂量可适当増加），共5次。 最后1次注射后10天试血，合格者采血。

小剂量多途径快速法:综合足掌、淋巴结、肌肉、静脉多点注射，共注射8次。前4次 每周注射1次福氏完全佐剂（或不完全佐剂）蛇毒抗原，后4次每3天注射1次蛇毒抗原 (无佐剂），          第8次注射后的5天试血，合格者采血，如效价不理想可再补1针。此法特点是 抗原用量小，免疫期短，抗体产生快和效价高。现将通常的小剂量快速法制备蛇毒免疫血 清方法(李云龙等，1980)介绍于表3-16-7。

表3-16-7兔子免疫过程

次

抗原剂量(mg干毒）

注射途径

 

序

尖吻蝮毒

蝮蛇毒

竹叶青蛇毒

眼镜蛇毒

银环蛇毒

 

1

0. 2(油抗原)

0. 2(油抗原）

0. 2(油抗原）

0. 05(油抗原）

0. 01(油抗原）

两前足掌

2

0. 3(油抗原）

0.3(油抗原）

0. 3(油抗原）

0. 1(油抗原）

0.02(油抗原）

两后足掌

3

0. 4(油抗原）

0.4(袖抗原）

0. 4(油抗原）

0. 2(油抗原）

0. 03(油抗原）

背部皮下

4

0. 5(油抗原）

0.5(油抗原）

0.5(油抗原）

0.3(油抗原）

0. 05(油抗原）

两臀股

5

1.0(纯毒抗原）

1.0(纯毒抗原）

1.0(纯毒抗原）

0.5(纯毒抗原)

0. 1(纯毒抗原）

两臀肌

6

1. 5(纯毒抗原）

1. 5(纯毒抗原）

1.5(纯毒抗原）

1.0(纯毒抗原）

0. 2(纯毒抗原）

耳静脉

7

2. 0(纯毒抗原）

2. 0(纯毒抗原）

2. 0(纯毒抗原）

2. 0(纯毒抗原）

0. 3(纯毒抗原）

耳静脉

8

3. 0(纯毒抗原）

3. 0(纯毒抗原）

3. 0(纯毒抗原）

3. 0(纯毒抗原）

0. 5(纯毒抗原）

耳静脉

 

 

.④采血分离血清：一般采取一次放血。家兔和羊用颈动脉放血法，大动物如羊等也 可采取多次放血法收集血清，豚鼠1次抽血未死者，隔2日后还可再取1次。血液应用 无菌器皿盛放，操作时应尽量避免污染。血液采集后一般先置37€温箱lh，再放4€冰 箱过夜。待血块收缩完全后离心分离血清，加入防腐剂(0.01%硫柳汞或0.05%叠氮化 钠)或经除菌过滤、分装。也可加入等体积甘油在一 2(TC低温保存或经冷冻干燥保存，待 纯化。

抗蛇毒血清的纯化纯化工作大体分为两类。一类是提高抗蛇毒血清的特异性，另 一类是提纯免疫球蛋白（如IgG等）。

(1)抗蛇毒免疫血清共同抗体的免疫吸收：

液相免疫吸收法:将共同抗体(杂抗体)相应的蛇毒抗原按需要的量加入搅匀，经 37°C作用3h，4"C放过夜，离心去除共同抗原抗体复合物。例如要提纯五步蛇毒的种特异 性抗体，          第一步先用琼脂免疫扩散法测出交叉抗原有蝮蛇毒、竹叶青蛇毒和烙铁头蛇毒;           第二步用固定抗体法，在一系列每管含0. 05ml五步蛇毒血清的试管中分别加入按倍比 稀释的一系列某交叉反应的蛇毒溶液0.5ml混匀，37°C孵箱中观察，以出现沉淀反应最 快、最明显的试管，或放2min后取出置冰箱过夜，肉眼观察抗体抗原复合物的沉淀量 或摇匀比浊，以复合物最多而蛇毒抗原最少的一管作为等价管，该管蛇毒含量即是 0. 05ml血清所要加入的吸收蛇毒量;          第三步在一定量的五步蛇毒抗血清中，加入按上法 算出的这3种具有共同抗原的蛇毒液的吸收所需量，充分混合，37X：冰箱孵育3min(经常 摇动），取出放4°C过夜。4 000r/min(l(TC)离心15min，取上清液。经鉴定合格后分装(共 同抗体吸收后再通过透析袋透析或经超滤浓缩去除残留蛇毒则更好）。按上面介绍的方法

保存备用（如1次吸收不全可按此法再吸收一遍，直至彻底吸收为止）。鉴定用琼脂免疫扩 散法进行。将纯化的五步蛇毒种特异性抗血清放在中间孔内，四周孔分别放入这4种蛇 毒，将此琼脂板放入湿盒内，在37°C (或室温中)置24h后观察结果。如果仅在五步蛇毒与 被提纯抗毒血清孔间出现沉淀线，而其他无沉淀线出现，即表示此种特异性抗蛇毒血清已 提纯。也可用蝮蛇毒、竹叶青蛇毒、烙铁头蛇毒致敏的天然胶乳或致敏血细胞，分别同待检 五步蛇种特异性抗体做间接凝集试验，如皆为阴性也说明已提纯(此法更为敏感）。

固相免疫吸收法(亲和层析法）：将抗蛇毒血清通过已活化的Sepharose 4B与交叉 蛇毒交联的固相吸附柱进行吸收提纯。如制备蝮蛇毒种特异性抗体，可用适当量的溴化氢 活化的Sepharose 4B(有市售品），也可按下法自制：取20ml经洗净的Sepharose 4B至有 磨口的100ml三角烧瓶内，再加入预冷的5mol/L碱性磷酸钾缓冲液100ml置通风橱内， 然后再倾入新鲜配制的已溶解的10%CNBrl0ml，在电磁搅拌下滴加2mol/L NaOH使 pH维持在11左右，反应温度保持在15'C〜2(TC，反应8min〜12min,再迅速将三角烧瓶 内容物移入1号砂蕊漏斗中，用300ml冷蒸馏水迅速抽至中性，再用500ml预冷的 0. lmol/L pH9. 0 NaHC03洗漆、抽滤至干，即成活化的琼脂糖凝胶〔如同一定量的右旋 糖酐(Dextmn)和乳糖一同冷冻干燥在8X：以下保存，长期使用〕冻干粉剂，用10_3mol/L HC1溶液(每克干粉用200ml)充分溶胀洗去稳定剂，并用0. lmol/L NaHC03抽滤后按每 克干粉结合l0mg蛋白质的比例，同一定量的0. lmol/L pH9. 0NaHCO3 (含0. 5mol/L NaCl)充分透析、平衡过的五步蛇毒溶液(5mg/ml)—起混合，4X：下缓慢搅拌过夜(16h〜 20h)。取出交联蛇毒的琼脂糖珠装入1. 5cm X 15cm的层析柱内（约装30ml)，先用 0. lmol/L pH9. 0 NaHC03 (含 0. 5mol/L NaCl) 150ml 洗去未结合蛋白，再用 pH7. 0, 0. 05mol/L(含0. 14mol/L NaCl)的磷酸缓冲液继续淋洗，收集全部洗脱液，直至洗脱液 在紫外分光光度计280nm下的A值<0. 10〜0. 05为止。然后用pH8. 0，lm0I/L的乙醇 胺20ml洗柱，使其在柱床中停留lh〜2h，同时测定lmol/L乙醇胺在280nm的A值，按 xml数计算上柱溶液的总A值。一并收集洗脱液测其A值。最后再依次用pH4.0, 0. lmol/L(含 0. 5mol/L NaCl)醋酸缓冲液 20ml，pH8. 0,0. lmol/L(含 lmol/L NaCl)砸 酸缓冲液20ml及pH7. 0,0. 05mol/L(含0. 14mol/L NaCl)的PBS洗脱，洗去未共价吸附 的蛇毒，直至A值<0.03。至此免疫吸附柱制备完成。按上法再分别制备竹叶青蛇毒、烙 铁头蛇毒的免疫吸附柱。然后将经PH7. 0,0. 05mol/L PBS充分透析平衡的蝮蛇毒血清 分别通过以上3种具有共同抗原的免疫吸附柱。方法是将抗蛇毒血清3ml〜5ml缓缓滴 入柱内，使流速为l0ml/h，待全部抗蛇毒血清进入柱后用pH7. 0,0. 05mol/L PBS轻轻淋 洗管壁，然后旋紧出口。在室温下置2h以上或4°C过夜，然后打开下口，用pH7.0, 0. 05mol/L PBS洗脱，使流速为lml/min，收集洗脱液至280nm的A值<0. 05为止。按 此法连续通过这3种蛇毒免疫吸附柱，最后收集液体集中浓缩。待检合格后即为蝮蛇毒种 特异性抗体（如吸收不够彻底可将柱再生后再吸附1次。柱再生方法是：用PH2.8, 0.1m0l/L甘氨酸-HC1缓冲液洗脱吸附柱至280nm的A值<0.05,再用pH7.0, 0. 05mol/L PBS 淋洗至 A 值<0. 05 为止）。

(2)抗蛇毒血清中IgG的纯化：

硫酸铵盐析、DEAE-纤维素纯化：行经硫酸铵盐析，脱盐后再经DEAE-Cellulose 纯化。

慢慢滴加4°C饱和硫酸铵溶液(40ml),边加边搅拌，4°C放置过夜(或30minh9 OOOr/min， 10°C离心 20min(4 OOOr/min，离心 30min)

DEAE-纤维素纯化:取DEAE-纤维素20g，悬浮于0. lmol/L NaOH中过夜，用布氏 漏斗以双层滤纸抽滤，以无离子水和0. lmol/L NaOH交替抽滤洗涤各3次，每次约 150ml。最后用无离子水抽滤洗涤3次后将纤维素悬浮于约500ml磷酸缓冲液 (0. 015mol/L，PH6. 3,以下简称PB)中，并用PB滤洗到pH平衡止。将纤维素悬浮于PB， 适当漂洗除去微细颗粒，然后装入层析柱（02. 5cmX25Cm)，滴洗到床体积稳定，流速控 制在100ml/h以上。经PB平衡的IgG粗制品40ml上样于纤维素柱，用PB滴洗，流速 50ml/h〜100ml/h分部收集流出液，测定OD28(to，直到流出液OD28„nm<0.1。将含蛋白的 各管合并，经适当浓缩，并对拟用以保存此IgG的缓冲盐水液透析平衡，按OD28„nmlcm = 13. 5计算IgG浓度和得率。纤维素柱再经适量0. 5mol/L NaOH滴洗除去吸附的血清蛋 白，然后将纤维素转入烧杯，用无离子水漂洗3次，用0. lmol/L NaCl漂洗3次，用无离 子水洗去碱，用0. 5mol/L HC1漂洗3次，再用无离子水漂洗3次，抽滤除去HC1，最后用 碱处理，再用无离子水抽滤至中性，放4 °C冰箱备用。

②QAE-Sephadex-离子交换层析纯化法：取QAE-Sephadex A 50 4g悬浮于500ml 无离子水中，室温过夜或沸水浴2h。漂洗3次后装入2. 5cm〜25cm层析柱，用乙二胺-醋 酸缓冲液(Tu = 0. l,pH7. 0)滴洗平衡。将已经等体积平衡缓冲液稀释并透析平衡过夜的 40ml抗蛇毒血清样品上样于凝胶柱，并用平衡缓冲液滴洗，流速50ml/h〜100ml/h分部 收集流出液，测定各管0D28tom，直到流出液OD2Mimi<0. 1、流出液呈二个紧相连的蛋白 峰，即是IgG。合并后按OD28Q„ml%，lCm=13. 5计算IgG浓度和回收率。凝胶柱用约5倍 床体积的再生缓冲液(醋酸铵-醋酸缓冲液，Tu = 0. 5，pH4. 0,配制方法:取醋酸铵11. 6g

加lmol/L醋酸870ml，用无离子水稀释至1 000ml,加Tritonx-100液10ml)滴洗再生， 除去吸附的血清蛋白，再用平衡缓冲液滴洗平衡备用。

葡萄球菌蛋白SPA-Sepharose柱层析纯化:取SPA-Sepharose-4B(按上面介绍的 CNBr活化法制备）10mg加到40ml 0. lmol/L，PH7. 4 PBS中，洗4次装柱，用PBS洗柱 后加样，即加入经洗柱的PBS充分平衡的抗蛇毒血清适量，控制流速为10ml/h。待全部 样品进入吸附柱后，关闭流出口 3h以上，再用以上PBS洗柱，至洗出液0028»„_„<0.05。然 后再用酸性PBS解吸附洗脱，收集洗脱液至OD28()„m<0. 05。用PBS再洗柱，使柱再生，保 存再用。

抗蛇毒血清全抗体的纯化:可以用亲和层析法纯化。方法基本上同抗蛇毒血清共 同抗体的免疫吸收的亲和层析法，不同之处只是:①抗蛇毒血清通过相应蛇毒与CNBr活 化的Sepharose 4B交联的亲和层析柱;②用0. lmol/LpH2. 8甘氨酸-HC1缓冲液解吸附 洗脱时再收集洗脱液。

抗蛇毒血清纯度的测定：

醋酸纤维膜电泳:仅在7-球蛋白区带出现蛋白带，为纯化IgG或纯化全抗体。

琼脂免疫电泳:待检抗蛇毒血清电泳后与抗 >球蛋白抗体免疫扩散,仅出现IgG 沉淀线者为纯化IgG。

琼脂免疫双扩散:待检抗蛇毒血清孔与相应蛇毒孔之间出现数条沉淀线，与抗IgG 血清孔及抗球蛋白血清孔之间仅出现相同的1条〜2条沉淀线，而与抗白蛋白血清孔、 抗IgM血清孔不出现沉淀线，为纯化IgG。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（圆盘电泳）：在相应的7-球蛋白区带范围内出现蛋白环（可 能一至几个环），其他区带无蛋白带则为纯化IgG。