蛇毒蛋白分离技术纯化标准

建立成功的纯化方案通常耗费时间和材料。在花费了如此多的金钱和精力之后，应该可以绝对可靠地测量制剂的质量或纯度。遗憾的是，没有高权威的测试方法，人们不可能简单地证明某物是纯净的。反之，当一个样品在一定条件下被分成两部分，并且各自表现出不同的性质时，很容易证明它是不纯的。纯度最终取决于所用方法的分辨率和类型。如果用改进的分辨率方法测量，则通过低分辨率方法认为是纯的制剂很容易被证明是不纯的。例如，如果使用SDS 电泳等高分辨率技术，纯度仅指制剂在分子量方面的均匀性。如果使用酶法检测污染，分辨率

尽管增加量更高，但它仍然仅针对所检测的特定酶。更好的纯度标准是建立多个指标，每个指标衡量不同的特性。以下是纯度指标，但只有在综合考虑时才具有说服力。

(1)离心均匀性

可以使用超速离心机分析蛋白质纯度。在沉降分析中，纯蛋白质在离心力的影响下以单一沉降速度运动。由于沉降速度基本上由分子的大小和形状决定，与化学成分无关，因此作为鉴定纯度的方法不如电泳。

(2)色谱的均匀性

利用各种层析，如离子交换层析、吸附层析、凝胶层析等，不仅可以分离蛋白质，而且可以证明蛋白质的一定纯度。但是，它比电泳法差。柱层析法常有一个峰，而电泳法可能有数条带。

(3) 收费均匀性

利用电泳检测蛋白质纯度是最常用的方法之一，尤其是在使用聚丙烯酰胺凝胶后，使得该方法在评价蛋白质纯度方面发挥了主要作用。仅显示一条带的凝胶电泳可用作纯度指标。然而，实际上，这只能说明该区内各种物质的荷质比是恒定的。然而，如果在不同的pH 值下进行电泳，结果的可信度会增加。

(4)等电聚焦法

该技术仅根据蛋白质的等电点来分析蛋白质的纯度。细胞中有10,000 到50,000 种蛋白质。它们的等电点主要分布在pH 4~10之间，重叠明显。如果假设分布是均匀的（实际上是不均匀的），簇在PH48之间，每个pH单位有7000种。

(5) 免疫化学的一致性

免疫学特异性非常敏感，可以用特异性抗体定量鉴定蛋白抗原的纯度。这种方法称为免疫化学同质性。

(6)恒溶法

纯蛋白质在特定溶剂系统中具有恒定的溶解度，与溶液中存在的未溶解固体的量无关。恒定溶解法鉴定蛋白质纯度理论上严格，但在实验上也简单易行。在严格定义的条件下，添加的固体蛋白质与溶解的蛋白质作图。如果蛋白质产品是纯的，那么溶解度曲线只会出现一个拐点。在拐点之前，直线的斜率为1，在拐点之后，斜率为零，如图3-13-19所示。不纯蛋白质的溶解度曲线通常显示出两个或多个断裂点。

(7)结晶法

蛋白质只有在相当纯的时候才能结晶，所以结晶也可以证明蛋白质的相对纯度。但是，这种方法作为衡量蛋白质纯度的标准也有相当大的局限性，因为结晶蛋白质也可能含有微量杂质，结晶方法无法区分同一晶型的不同蛋白质。

(8) 功能的统一性

许多蛋白质具有特殊的功能特性，即这些蛋白质起着激素、酶等作用，因此常采用检测功能特性的方法来鉴定蛋白质的纯度。

(9) 末端分析及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

只有当纯化的蛋白质由一条多肽链或一组相同的亚基组成时，这些方法才具有很大的价值，这不是蛋白质的一个非常普遍的特征。

简而言之，纯度要求越严格，必须使用的分析技术就越多，必须评估的数据就越有问题。在这些测定蛋白质纯度的方法中，最常用、更简单、分辨率更高的方法是聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳。