蛇毒类毒素研究进展

蛇毒经甲醛解毒成为类毒素后，仍能保留其抗原性。蛇咬伤的防治关键在于及时、准确、有效的治疗，但实际上往往很难及时预防或难以预防大剂量蛇毒引起的病变的发生。如果用蛇毒类毒素对可能被毒蛇咬伤的人进行人工自动免疫，免疫后的人体能及时抵抗蛇毒的作用，避免局部和全身严重病变，也能赢得有效的治疗时间。这对提高治愈率，减轻或避免疼痛起着重要作用。 1960年代初，Moror-Perlmuter等人用甲醛解毒巴勒斯坦蜂蛇和银鳞毒蛇的毒素，试图制备类毒素。后来，Sawai 等人。等采用二氢硫辛酸解毒法制备出对实验动物具有良好免疫原性的黄绿色铁头蛇毒类毒素。他们首先提出使用类毒素进行人群免疫的可能性，并在日本奄美大岛提供。 （Amami）和Byukyu 首次为40,000 多名志愿者接种疫苗，结果大大减少了严重组织坏死病例的发生。从那时起，Oknogi 等人。曾用乙醇和甲醛对黄绿色烙铁头类毒素进行解毒纯化，免疫效果好，无副作用。 Sadahiro 和Kondo 等人。制备的甲醛黄绿色毒素产生的抗出血毒素抗体优于二氢硫辛酸黄绿色毒素。 Sadahiro、Kondo等还制备了甲醛出血毒素成分（HR和HR2）混合类毒素。此类毒素的HR 类毒素部分的相对效力为8.0（置信限度2.4-2.71），类毒素部分的相对效力为0.7（可信限度0.2-2.6）。用这种类毒素免疫的猴子可以完全抵抗5mg黄色

青铁头蛇毒的攻击，部分猴子也能抵抗10mg粗毒的攻击。志愿者的免疫注射未发现副作用，两次注射后血液中可检测到一定量的抗体。 1972 年，Sawai 等人。采用乙醇沉淀法对粗毒进行低温提纯，再用甲醛脱毒制备出抗组织坏死效果较好的乙醇-甲醛黄绿色铁头蛇毒素。 1972年，染谷等人进行了用各种方法制备的各种黄绿色铁头蛇毒素对人体免疫的实验。 1978 年，Sadahiro 等人。发表了黄绿色铁头蛇毒的标准类毒素。杜马雷等。用甲醛和戊二醛对黑颈眼镜蛇毒进行解毒，制备出黑颈眼镜蛇类毒素。 1979年，日本公布了Omotokioka等人的专利公报。从蕲蛇毒蛇毒类毒素的生产方法开始，日本政府同时制定了黄绿色铁头蛇毒类毒素生物制品的操作规程。 1982年，马来西亚研制出一种具有较高预防价值的白蛇类毒素。目前已制成虎蛇类毒素。据介绍，这些类毒素在预防毒蛇咬伤方面取得了积极的效果和良好的应用价值。

我国上海生物制品研究所和福建医学院对甲醛进行脱毒制备五步蛇类毒素，用于注射马、兔等动物制备抗蛇毒血清，探索防治毒蛇咬伤的可能性。安徽中医学院李云龙等等采用甲醛脱毒法制备出符合生物制品要求、具有良好免疫原性的吸附磷酸铝的青蛇类毒素，并进行了多方面的详细研究。

二、蛇毒类毒素制备方法

蛇毒的解毒方法有甲醛法、戊二醛法、二氢硫辛酸法、谷胱甘肽法、亚甲蓝法、依地酸法和7射线照射法等，但与甲醛法相对稳定，免疫原性较好。下面介绍几种常用的蛇毒类毒素制备方法。

(1)渐量甲醛解毒法

先用33.3mol/L磷酸盐缓冲液将蛇毒（或纯化蛇毒或粗蛇毒）制成浓度为1%，然后在第1、3、5、7天分别加入0.2%的甲醛（V/V )，最终甲醛含量为0.8%(V/V)，在培养箱中进行脱毒。 10天后，每天取出注射的小鼠进行毒性检查，直至完全解毒。加入0.01%硫柳汞（W/V），用50倍无菌生理盐水于4冰箱透析2天3天，除菌过滤后进行LF、氮含量、甲醛浓度测定和无菌检验。然后根据氮含量稀释至所需浓度（含3mg/ml蛋白质），加入吸附剂磷酸铝使之为1.3mg/ml。组成0.01% 硫柳汞(W/V)，并装入安瓿瓶中。管理检验和无菌检验合格为成品，4保存备用。

(2)初级甲醛解毒法

用新鲜配制的无菌0.2%（W/V）甲醛和PBS（66.7mol/L，pH 7.0）解毒，无菌操作配制2mg/ml（W/V）蛇毒溶液（如蕲蛇毒液），置37解毒，7天后每天检查解毒情况，直至完全解毒。加入0.01%硫柳汞（W/V），在无菌操作下用50倍以上无菌生理盐水4透析48小时，进行LF、氮含量、甲醛浓度测定和无菌检验。

吸附剂吸附采用磷酸铝吸附使浓度为1%1.5%，加入0.01%硫柳汞（W/V），摇匀。无菌操作下的分包装、瓶封和标签。理化性质抽样和无菌检验。也可以在弱酸或弱碱或中性环境下，在10mg/ml蛇毒生理盐水中加入0.2%甲醛（W/V）解毒，然后用无菌生理盐水稀释至2mg/ml浓度，并使用铝盐吸附而成。检验合格后为吸附甲醛蛇毒类毒素，保存于4X：冰箱中备用。

(3)低温乙醇提纯甲醛解毒法

用无菌pH 7.0、16.7mol/L磷酸盐缓冲液配制蛇毒（如黄绿色铁头蛇毒）浓度为1%，-1CTC加纯酒精使终浓度为30%，置于-3CTC中5h，最后于-10以1000 Or/min离心30min，将沉淀重悬于pH 7.0的PBS中，分4次加入甲醛使终浓度为1 %。脱毒后用无菌生理盐水透析，灭菌过滤，加入防腐剂，用磷酸铝（1.35mg/ml）吸收，使终蛋白含量为1mg/ml，化学合格即为低温乙醇甲醛解毒类毒素的纯化及微生物试验。

(4)戊二醛解毒法

(五）二氢硫辛酸脱毒法

新鲜配制25mg/ml蛇毒（如黄绿烙铁头蛇毒）生理盐水溶液，以300r/min离心 lOmin，上清液经除菌过滤，无菌试验确定无菌，按50mg/2ml分装于小瓶，冷冻干燥。每瓶 干燥毒加入无菌0. 5%二氢硫辛酸溶液10ml，溶解后置37°C lh脱毒，这时呈pH7. 2的乳 白色溶液。加入防腐剂后，经无菌、安全、理化检定合格即为二氢硫辛酸蛇毒类毒素。也可 加入吸附剂制成吸附二氢硫辛酸蛇毒类毒素。

(六）7射线照射脱毒法

用100KR的7射线照射圆斑蝰蛇毒,可使其脱毒而保留抗原 性，而成为蛇毒类毒素。